等电点法提取酪蛋白的方法改进

杨勇，徐志霞，黄循吟，汪继超，王锐萍，张文飞

（海南师范大学生命科学学院，海南海口571158）

等电点法提取酪蛋白的方法改进

杨勇，徐志霞，黄循吟，汪继超，王锐萍，张文飞*

（海南师范大学生命科学学院，海南海口571158）

为提高酪蛋白的提取效果，通过探究预先脱脂牛奶和未预先脱脂牛奶在不同pH（4.5、4.6、4.7、4.8、4.9）条件下沉淀酪蛋白的效果，得出了先离心脱脂，然后在pH 4.6的条件下进行酪蛋白凝集，最后在离心管中悬浮沉淀洗涤，可以达到最佳的提取效果，得率和纯度分别是98.58%和97.52%.实验结果表明，该法操作简单，可有效提高酪蛋白的提取效果和纯度，缩短提取时间，实验教学效果良好.

脱脂；酪蛋白；沉淀

牛奶的主要成分为蛋白质，脂肪，乳糖和矿物质等，均为人体代谢提供必需的营养物质，被认为是营养成分最为完善的食品之一[1].牛奶中的蛋白质主要成分是酪蛋白，其含量大约在35 g/L，占总蛋白量的80%，因其所占的比例比较稳定，受其他因素影响较小，根据这一性质，可以用其判断牛奶品质[2].酪蛋白成分复杂，主要含有4个亚型：α1酪蛋白、α2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白.它们的纯净物为白色，无味的颗粒状固体[3].

根据蛋白质在其等电点溶解度最低的原理，在一定的温度下，用缓冲液将牛奶的pH值调整到其等电点，酪蛋白即可以发生沉淀，酪蛋白不溶于水和有机溶剂，用蒸馏水和有机溶剂洗涤沉淀中的杂蛋白和脂类等其他物质，便可得到较为纯净的酪蛋白[4].然而，传统的方法常常会出现难以脱去全部的脂肪，得到的酪蛋白超出理论值，颜色发黄，纯度较低的现象，又因为不同的文献对等电点的说法也不一[1，4-6]，容易造成误解.因此本研究通过改进原有的脱脂方法，来寻求最合适等电点，提高酪蛋白的纯度，为实验教学提供参考依据.

1　材料与方法

1.1仪器、试剂与材料

分析天平（常州奥豪斯SE602），酸度计（美国丹佛UB-7），恒温干燥箱（上海一恒），离心机（长沙湘仪TDZ4-WS），恒温水浴锅（金坛金南仪器HHW600）等.

95%乙醇、无水乙醚、乙醇乙醚混合物（1∶1）、0.2 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，pH分别是4.5、4.6、4.7、4.8、4.9，酪蛋白（A.R.），以上试剂均为国产分析纯试剂.

250 mL伊利牌盒装纯牛奶（酪蛋白含量：3.1g/ 100mL），购于海口市大润发超市.

1.2方法

预先脱脂：量取牛奶20 mL置于50 mL离心管中，4000 r/min离心10 min，取出后用玻璃棒挑去牛奶上层的脂肪层.同时取未进行脱脂的样品作对照.

沉淀：将盛有牛奶的离心管置于40℃的水浴锅中预热，边搅拌边在不同离心管中分别加入pH值4.5、4.6、4.7、4.8、4.9的已在40℃预热的醋酸钠缓冲液，冷却至室温，然后4000 r/min离心5 min，沉淀既为酪蛋白粗品.

水洗：用20 mL蒸馏水悬浮沉淀并振荡混匀，4000 r/min离心3 min后弃上清液，沉淀再重复水先2次.

再脱脂：用95%乙醇10 mL彻底悬浮沉淀并振荡混匀，4000 r/min离心3 min，弃上清液后，用乙醇乙醚混合物（1∶1）洗涤沉淀2次，最后用无水乙醚再洗涤沉淀2次.

计算得率：将离心管中的沉淀置于50℃烘箱内烘干2 h后称量，计算出不同pH缓冲液沉淀酪蛋白的得率.

绘制标准曲线：称取酪蛋白纯品0.1 g溶于0.1 mol/mL的NaOH溶液中并定容100 mL，配制成1 mg/ mL的酪蛋白标准液.以标准液分别配制2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的酪蛋白溶液，用0.1 mol/mL的NaOH溶液校零，测定各组在280 nm处的吸光值.以酪蛋白的浓度为横坐标，280 nm处吸光值为纵坐标，绘制标准曲线.

纯度测定:称取样品酪蛋白0.1 g溶于0.1 mol/ mL的NaOH溶液中并定容100 mL，测定溶液在280 nm处的吸光值，根据标准曲线，求出样品中酪蛋白的含量.

2　结果与分析

2.1酪蛋白量的测定

以20 mL伊利牌纯牛奶作为实验材料，用pH值为4.5、4.6、4.7、4.8、4.9的醋酸-醋酸钠缓冲液沉淀酪蛋白，预先脱脂和未预先脱脂的样品各重复5次，提取酪蛋白的质量见表1和表2.通过单因素方差分析，表明各pH组之间存在极显著差异，预先脱脂和未预先脱脂提取量最多的pH均为4.6.

表1　预先脱脂，不同pH值缓冲液沉淀酪蛋白的量(g)Tab.1The recovery rate of casein from skimmed milk in buffer solutions with various pH value

表2　预先脱脂，不同pH值时，酪蛋白含量方差分析表Tab.2The ANOVA table for the content of casein from skimmed milk in buffer solution with various pH value

2.2标准曲线的绘制

根据测得的数据，以酪蛋白浓度为横坐标，280 nm处吸光值为纵坐标绘制酪蛋白标准曲线，见图1.

2.3纯度的测定

根据标准曲线，测得预先脱脂和未预先脱脂的牛奶在各pH下提取酪蛋白的纯度的平均值见表3.实验结果表明，在不同pH值下沉淀的酪蛋白，预选脱脂提取的纯度均高于未预先脱脂的纯度.

3　讨论

实验结果表明，预先脱脂，并用pH4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液沉淀酪蛋白得率最高，达到了0.611g/20 mL，得率达98.58%.实验结果也表明，预先脱脂的纯度高于未预先脱脂的纯度.本法得到的酪蛋白均为白色粉末，颗粒较少.

由于该实验全部操作过程都在离心管中进行，采用蒸馏水和有机溶剂悬浮酪蛋白沉淀，再通过离心分离，省去了传统方法中的抽滤洗涤脂肪[4]步骤，既减少了实验过程中中间环节的损耗，又可以使蒸馏水和有机溶剂充分接触酪蛋白粗品，提高了洗涤杂质的效果，减少了实验误差.因此建议，在以后的教学过程中，可预先脱脂，再用pH 4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液沉淀酪蛋白，可以达到更好的实验效果.

图1　酪蛋白标准曲线Fig.1Casein standard curve

表3　未预先脱脂，不同pH值缓冲液下得到酪蛋白的量(g)Tab.3The recovery rate of casein from milk in buffer solutions with various pH value

表4　预先脱脂，不同pH值时，酪蛋白含量方差分析表Tab.4The ANOVA table for the content of casein from milk in buffer solution with various pH value

表5　预先脱脂和未预先脱脂提取酪蛋白的纯度对比Tab.5The purity comparasion of casein extracted from milk and skimmed milk

[1]邵锦震,易理清.等电沉淀法分离酪蛋白方法的探讨[J].湖北师范学院学报,2004,24(1):19-22.

[2]朱晓莹,覃靖娟,朱日生,等.等电沉淀法提取酪蛋白的实验方法改进[J].卫生职业教育,2013,31(9):93-94.

[3]周志伟,盛东生,许永红,等.定量分析加热后乳清蛋白与酪蛋白的结合[J].食品工业科技,2000,21(5):28-30.

[4]陈均辉,李俊.生物化学实验[M].5版.北京:科学出版社, 2014:103-104.

[5]陈忠平.牛奶中酪蛋白和乳糖的分离[J].安徽技术学院学报,2001,15(4):58-59.

[6]韩珍琼,方建华.实验室制备牛奶酪蛋白的技术研究[J].畜牧与饲料科学,2010,31(8):83-85.

责任编辑：毕和平

The Optimization of Extracting Casein in the Isoelectric Point

YANG Yong，XU Zhixia，HUANG Xunyin，WANG Jichao，WANG Ruiping，ZHANG Wenfei*
（School of Life Science，Hainan Normal University，Haikou 571158，China）

To improve the extraction of casein,this study explored extraction efficiency of casecn from milk and skimmd milk in different pH（4.5、4.6、4.7、4.8、4.9）.It concluded that casein from skimmed milk aggregated in pH 4.6 and then sus⁃pended and washed precipitate in the centrifuge tube,could achieve the best extraction results.The yield and purity were 98.58%and 97.52%respectively.This study simplified the experimental procedure,effectively raised the purity of casein, shortened the extraction time,and the effect of experimental teachingwas improved significantly.

skimmed；casein；precipitate

Q 503

A

1674-4942（2016）01-0109-03

2015-11-19

海南师范大学生物科学特色实验教学示范中心项目