高效液相法测定当归补血丸中阿魏酸含量

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【摘要】 目的 建立高效液相法（HPLC）测定当归补血丸中阿魏酸含量的方法。方法 采用HPLC测定当归补血丸中的阿魏酸含量， C18柱：4.6 mm×250 mm， 5 μm；流动相采用甲醇-1.0%冰醋酸溶液。结果 阿魏酸在5.00～80.00 ?g/ml浓度范围与峰面积具有良好的线性关系（r=0.9998）， 回收率为98.86%， RSD=1.13%。结论 采用HPLC测定当归补血丸中的阿魏酸含量具有简便、准确和灵敏的优势， 可用于对当归补血丸进行质量控制。

【关键词】 当归补血丸；高效液相法；阿魏酸

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.24.213

当归养血丸主要是由当归、黄芪、白芍与地黄等10味中药组成， 具有养血、益气与调经等功效， 临床上多用于治疗月经不调、气血两虚等疾病， 并且可获得满意的疗效。2005年版《中国药典》法定标准钟仅对当归显微鉴别项目、丹皮薄层鉴别方法进行了收录， 这对药品的生产与使用质量造成一定的限制[1]。基于此， 本研究参考相关文献， 对高效液相法测定当归补血丸中阿魏酸含量方法的建立进行了研究， 借以更好的控制药物的质量。

1 仪器与试剂

1. 1 仪器 高效液相色谱仪， 型号为Thermo fisher U3000， 以及配套工作站（包括紫外与荧光检测器等）；生产厂家：Thermo fisher；C18柱：4.6 mm×250 mm， 5 ?m；电子分析天平， 精密度为0.0001；紫外可见分光光度计， 型号为TU-1900。

1. 2 试剂 甲醇， 水为超纯水， 其他试剂均为分析纯。阿魏酸对照品生产批号为20131015， 生产厂家：中国药品生物制品检定所；当归养血丸源于市场销售同一生产厂家， 生产批号为140306、140501、140701、140901、141101。

2 方法与结果

2. 1 色谱条件选择 采用HPLC高效液相色谱法对当归补血丸中的阿魏酸含量， C18柱：4.6 mm×250 mm， 5 ?m；流动相采用甲醇-1.0%冰醋酸溶液， 比例为25：75；检测波长为：320 mm；柱温：25℃；流速1.0 ml/min。；进样量10.0 μl。将阿魏酸峰值计算>3000作为理论塔板数。

2. 2 对照品溶液配制 精确称取0.10 mg阿魏酸对照品， 将其置入5 ml的容量瓶中， 然后加入甲醇溶液定容， 静置并作为备用。

2. 3 试验样品配制 采用电子天平准确称取当归养血丸10.0 g， 然后加入精确称取的硅藻土10 g， 混匀后研细， 并将其置于提取器， 加入200 ml 70%甲醇溶液后提取， 提取时间为5 h， 将提取液压缩到4 ml左右， 将残渣采用流动相进行溶解并转移（20 ml容量瓶）， 并加入流动相进行定容以备用。

2. 4 阴性样品配制 采用电子天平精确称取当归样品10.0 g， 然后根据“2.3试验样品配制”方法进行阴性样品的配制。获得的储备液置于棕色容量瓶中。

2. 5 干扰试验 取阿魏酸对照品溶液、试验样品溶液与阴性样品溶液10 μl， 注入液相色谱仪后进行检测， 获得图谱， 结果发现阴性对照品对本次试验检测并无影响。

2. 6 线性关系分析 精密吸取20 μg/ml浓度的阿魏酸对照品溶液置入2 ml容量瓶， 吸取体积分别为10、20、40、80、160和320 μl， 然后加入流动相定容， 分别吸取10 μl各浓度上述配制溶液注入到高效液相色谱仪中， 分别记录各自峰面积， 纵坐标表示峰面积， 横坐标表示进样量， 绘制标准曲线回归方程y=3.8642×104x+0.0538×104。结果显示， 阿魏酸5.00～80.00 μg/ml浓度范围与峰面积具有良好的线性关系（r=0.9998）。

2. 7 精密度分析 吸取10 μl试验样品溶液（来源于同一试样）， 重复5次进样， 测定其峰面积平均值， 测得RSD=1.13%。结果表明， 该方法具有良好的精密度。

2. 8 稳定性分析 吸取10 μl试验样品溶液（来源于同一试样）， 分别于0、2、4、8、16、20、24 h进样1次， 结果其RSD=0.94%， 表明阿魏酸24 h内是基本稳定的。

2. 9 重复性分析 取5份同一批号的样品， 根据“2.3试验样品配制”方法制备样品并对其阿魏酸含量进行测定， 参照线性结果， 样品中阿魏酸平均值为0.052 mg/g， RSD=1.54%， 具有良好的重复性。

2. 10 回收率分析 称取2.0 g左右同一批号（140901）已知阿魏酸含量样品， 共称取5份， 然后精密称定， 并加入2.4 ml 0.05 mg/g阿魏酸对照溶液， 测定其回收率。结果测得， 样品1～5号阿魏酸实测含量见表1， 阿魏酸回收率平均为98.86%， RSD=1.13%。

2. 21 样品含量测定 取5个批号当归养血丸试验样品， 制成待测溶液， 精密吸取10.0 μl供试样品溶液与对照品溶液， 注入到高效液相色谱仪中进行阿魏酸含量测定， 结果显示， 阿魏酸色谱峰与样品杂质峰可实现基线分离， 理论塔板数>3000。5批试样阿魏酸（140306、140501、140701、140901、141101）含量依次为：0.055、0.056、0.051、0.048、0.050 mg/g。

3 讨论

阿魏酸是当归养血丸中的一个主要成分， 稳定性不高， 在见光下容易发生分解， 因此阿魏酸对照品放置4 h后含量会出现下降， 因此在本次研究中采取了避光处理， 并在配制后及时使用[2]。制剂中阿魏酸含量在24 h内的变化并不明显， 比较稳定[3]。

大量参考文献关于流动相选择主要考察了不同比例甲醇-0.1%磷酸溶液， 包括25：75、30：70、45：55， 但其分离效果并不佳， 样品峰与杂质峰围着无法完全分离。本次研究中采用的流动相为甲醇-1.0%冰醋酸溶液， 比例为25：75， 经考察发现用于测定当归养血丸中阿魏酸含量具有良好的分离效果。在波长的选择中， 作者选择了200～400 nm位置的扫描， 结果发现， 检测波长在320 nm时， 吸收峰最大， 干扰少， 因此将其作为本次检测波长。2005年版《中国药典》中当归项中阿魏酸含量限度为0.05%[3]， 测定5个批次当归养血丸中的阿魏酸含量， 其含量应>0.035 mg/g。

综上所述， 本文中建立的高效液相色谱法测定当归补血丸中的阿魏酸含量具有简便、准确和灵敏的优势， 测定方法稳定， 通过对样品数据的反复考察， 该方法专属性强， 可用于对当归补血丸进行质量控制。

参考文献

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）. 北京：化学工业出版社， 2005：89.

[2] 何玲玲. 高效液相色谱法测定当归养血丸中阿魏酸含量. 中国医药导报， 2011， 8（3）：60-62.

[3] 付丽佳. 当归补血丸中阿魏酸溶出度测定. 中国实验方剂学杂志， 2013， 19（5）：144-146.

[收稿日期：2016-04-25]

【关键词】 巨大儿；因素；研究

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.24.212

巨大儿是产科常见的胎儿并发症之一， 是难产、新生儿产伤的高危因素。国内发生率约为7%， 国外发生率约为15.1%， 近年来有逐渐增加趋势[1]。多年来临床上采用各种方法力求提高胎儿出生体重估计的准确性， 但对胎儿出生体重的估计仍存在较大误差[2]。因此， 对巨大儿的致病机理进行分析， 进而对围产期的相关病理状况进行评估， 及时提出恰当的预防治疗方案。

1 巨大儿对母儿的影响

胎儿过大， 子宫壁张力增加， 收缩乏力， 腹部过度膨隆， 腹肌收缩无力， 给阴道分娩造成困难。肩难产处理不当， 可发生严重的软产道损伤， 严重者还会出现子宫破裂的问题。目前分娩的过程中还有可能出现盆底组织的裂伤， 继而导致子宫脱垂和阴道壁膨出现象， 还可引发尿瘘、粪瘘。巨大儿在分娩过程中， 容易造成新生儿窒息、部分巨大儿可能会终身肥胖， 同时巨大儿手术产率较正常胎儿明显增高[3]。

2 发生巨大儿的危险因素

2. 1 妊娠期糖尿病 妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus， GDM）也即母体在妊娠期间存在的糖尿病症状， 包含了一部分妊娠前已患有糖尿病但孕期首次被诊断的患者。1997年世界卫生组织（WHO）将GDM列为糖尿病的一个独立类型。GDM的发病机制尚不明确， 目前认为胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗可能是GDM的重要发病机制。随着孕妇体内血糖的增高， 过多的血糖可经由胎盘进入胎儿体内， 但是由于能够产生降血糖作用的胰岛素并不能通过胎盘血液屏障， 故而胎儿体内血液的血糖会较长时间处在过高情况， 这种情况会刺激胎儿自身胰腺激活， 分泌胰岛素， 进而增强胎儿的新陈代谢以及蛋白、脂肪等的合成， 进而可能导致巨大儿出现[4]。由于胎儿自身分泌的胰岛素能够促进其生长发育， 故而一旦孕妇出现妊娠期糖尿病， 特别是在妊娠的中后期， 一旦胎儿胰岛素的含量过高， 体内脂肪合成加速同时分解抑制， 相比于正常胎儿脂肪含量高出五成以上[5]。因此， 有效控制孕前体重， 孕期合理营养， 避免GDM发生以及对GDM孕妇进行膳食指导， 监测血糖， 是降低巨大儿发生的有效措施。

2. 2 营养因素 随着近年对孕妇营养状况的深入研究， 发现新生儿出生体重主要与孕妇的基础营养和孕期营养摄入有关， 其中孕妇的基础营养反映了孕前的营养状况。研究显示， 如果体内存在较之于常值过高的脂肪， 势必会对机体带来大量负面因素。相关学者[6]以1814例孕妇的孕前体质量指数（BMI）作为肥胖和正常体质量的筛选指标， 发现孕前肥胖组巨大儿的发生率为33.86%， 明显高于正常体质量组的2.0%（P<0.05）。崔宝奎[7]对3231例病例进行研究， 发现孕妇在妊娠期间体重过重， 很容易导致新生儿体重过重， 甚至出现巨大儿现象， 同时对于母体而言， 也有可能导致孕妇的妊娠期糖尿病、高血压等症状， 极其不利于妊娠安全。

2. 3 遗传因素 胎儿在孕妇体内最初生长的阶段其主要影响因素是遗传因素， 这些遗传因素通常通过对细胞和组织的生长的影响， 对胎儿初期生长发育起着至关重要的作用。遗传因素在影响胚胎发育的过程中， 胎儿的基因型有着非常大的影响力。其中性染色体携带的遗传因素可能会影响胎儿的体重， 有数据显示正常男婴通常比女婴的体重略高200 g左右。在脂肪堆积的肥胖过程中， 接近80%左右是遗传基因导致的。现阶段对肥胖的基因研究， 已经发现600余个与之相关的基因位点， 不同基因位点之间的协同作用进而影响机体的新陈代谢， 多基因共同影响产生肥胖[8]。宋春梅等[9]做家系调查发现巨大儿可能有家族遗传倾向。

2. 4 产次 经产妇相比于未生产过的产妇而言， 其自身机体腹壁及子宫壁相对更加松弛， 且环境对妊娠的关注度不足， 营养供给失度， 身体重量进而大幅度上升， 与此同时也极有可能使得胎儿体重过高， 罹患巨大儿症。相关数据显示， 产妇随着妊娠次数的提高， 不同产次胎儿的重量呈明显上升态势。刘月红等[10]将382例经产妇与2099例初产妇比较， 经产妇的巨大儿检出率（10.93%）高于初产妇（6.38%）， 差异具有统计学意义（P<0.05）。故而， 对产妇在妊娠期间的科学指导是防范巨大儿出现的有效措施。

2. 5 过期妊娠 过期妊娠即妊娠长于42周还没有将胎儿分娩下， 如果过期妊娠胎盘形态功能基本正常者， 能维持胎儿在宫内继续生长， 则发展为巨大儿。在同时存在糖尿病、肥胖和过期妊娠的妇女中， 巨大儿的发生率在5%～15%[5]。闫华[11]对大量足月和过期妊娠孕妇进行相关研究， 结果显示过期妊娠中巨大儿出现病例高达6.04%， 相比于足月妊娠的0.68%而言， 显然其存在更高的巨大儿危险隐患。

2. 6 妊娠期高血压疾病 孕妇孕前和孕期体质量增长过多， 可使脂肪组织明显增加， 导致孕妇及胎儿内分泌失调， 孕妇脂肪增加可引起体内活性雌激素水平升高， 通过醛固酮分泌， 经肾素-血管紧张素系统或通过增加肾小球重吸收， 引起钠潴留， 导致妊娠高血压疾病的发生。研究[12]发现高血压疾病是巨大儿发生的独立危险因素。另一方面， 妊娠期高血压可能引发胎盘的灌流量减少， 进而诱发急性动脉粥样硬化， 胎盘功能下降， 可致胎儿生长受限。

3 胎儿出生体重的产前预测

随着超声技术在产科的广泛应用， 超声检查已经成为监测胎儿生长发育、预测胎儿出生体重的重要手段。目前临床上预测胎儿体重方法多是采用统计学、多参数计算胎重。有学者指出在对妊娠后期的胎儿身体指标进行评价的过程中， 可以使用其腹围进行评价， 如果该值高于36 cm， 那么此次妊娠过程的胎儿罹患巨大儿的可能性将急剧增高[13]。另有学者提出使用B超并不一定能够起到非常精准的效果， 结合B超和腹围对妊娠期孕妇进行检查， 有利于对巨大儿身体指数进行科学有效快速的判断[14]。清楚孕妇及胎儿的生理状况， 对于孕妇顺利生产而言具有至关重要的作用， 同时对于产妇产前、中、后期及新生儿健康状况的预测提供更加可行的方案。