8-oxodG在口腔黏膜白斑中的表达

苏秋香，姚波，王旭光，杨丽，张素君，丁晓慧

（1.沈阳医学院基础医学院形态学实验室，辽宁沈阳110034；2.沈阳市第四人民医院口腔科；3.沈阳医学院基础医学院病理解剖学教研室；4.沈阳医学院附属卫生学校口腔学教研室；5.沈阳医学院基础医学院麻醉学专业2012级3班；6.组织与胚胎学教研室）

8-oxodG在口腔黏膜白斑中的表达

苏秋香1，姚波2，王旭光3，杨丽4，张素君5，丁晓慧6*

（1.沈阳医学院基础医学院形态学实验室，辽宁沈阳110034；2.沈阳市第四人民医院口腔科；3.沈阳医学院基础医学院病理解剖学教研室；4.沈阳医学院附属卫生学校口腔学教研室；5.沈阳医学院基础医学院麻醉学专业2012级3班；6.组织与胚胎学教研室）

目的：研究8-氧-7，8-二氢-2'-脱氧鸟嘌呤核苷（8-oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine，8-oxodG）在口腔黏膜白斑中的表达，探讨氧化性DNA损伤在口腔黏膜白斑发生发展中的作用及机制。方法：应用免疫荧光技术检测10例正常口腔黏膜和20例口腔黏膜白斑中8-oxodG和抑癌基因P53蛋白的表达。结果：HE染色可见口腔黏膜白斑中炎性细胞浸润，过角化和上皮异型性增生等组织病理学变化。免疫荧光标记显示8-oxodG在口腔黏膜白斑中生成，并可见抑癌基因P53蛋白的表达。口腔黏膜白斑中8-oxodG和P53蛋白的阳性表达率高于正常口腔黏膜（P＜0.01）；8-oxodG、P53在正常口腔黏膜、口腔黏膜白斑伴或不伴异型性增生的阳性表达程度具有相关性，与病变程度呈正相关（r=0.773，P＜0.01）。结论：氧化性DNA损伤在口腔黏膜白斑的发生过程中起着重要作用，8-oxodG可作为口腔黏膜白斑病变程度的风险性预测标志物。

口腔黏膜白斑；8-氧-7，8-二氢-2'-脱氧鸟嘌呤核苷；氧化性DNA损伤；P53

［Abstract］Objective：To study the expression of 8-oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine（8-oxodG）in oral leukoplakia for clarifying the role of oxidative DNA damage in the development of oral leukoplakia.Methods：Immunofluorescence labeling method was used to examine the expression of 8-oxodG，a marker of oxidative DNA damage，and the expression of tumor suppressor gene，P53 protein in oral epithelium of normal oral mucosa and biopsy specimens of leukoplakia.Results：In specimens of oral leukoplakia，HE staining showed infiltration of inflammatory cells，hyperkeratosis and epithelial dysplasia.Immunofluorescence labeling study demonstrated that the accumulation of 8-oxodG apparently increased in the oral epithelium of patients with leukoplakia，whereas little or no immunoreactivity was observed in normal oral mucosa.Expression of P53 protein was also observed in oral epithelium of patients with oral leukoplakia.The immunoreactivity of 8-oxodG and P53 was stronger in patients with oral leukoplakia than that in normal oral mucosa（P＜0.01）.Moreover，the immunoreactivity increased with the development of disease（r=0.773，P＜0.01）.Conclusions：The oxidative DNA damage contributes to the development of oral leukoplakia.8-oxodG may be a risk predictive marker for oral leukoplakia.

［Key words］oral leukoplakia；8-oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine；oxidative DNA damage；P53

口腔黏膜白斑是以白斑和过角化为特征的一种癌前病变［1］。5%～15%的口腔黏膜白斑在组织学上发生异型性增生。上皮细胞异型性增生的出现是癌发生的重要危险因素，部分伴有上皮细胞异型性增生的口腔黏膜白斑可发展为口腔癌［2］。活性氧参与癌前病变的发生，抗氧化剂能抑制口腔黏膜白斑等癌前病变损伤的发生。活性氧通过导致氧化性DNA损伤标志物——8-氧-7，8-二氢-2'-脱氧鸟嘌呤核苷（8-oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine，8-oxodG）生成，参与癌的发生过程［3］。

口腔黏膜白斑常伴有慢性炎症。发生口腔黏膜白斑时，炎症介质COX-2的表达增加。炎症发生时，一氧化氮合成酶催化一氧化氮的生成，且导致多种活性氮和活性氧的产生。但氧化性DNA损伤是否参与口腔黏膜白斑的发生及其在口腔黏膜白斑发生发展过程中的作用鲜见报道。本实验通过HE染色观察口腔黏膜白斑患者的组织病理学改变，利用免疫荧光染色检测8-oxodG和抑癌基因P53蛋白在口腔黏膜白斑中的表达，旨在阐明氧化性DNA损伤在口腔黏膜白斑发生发展过程中的作用。

1　材料与方法

1.1样本收集选取20例口腔黏膜白斑患者的活检样本，其中男7例，女13例，平均年龄（63.9± 9.6）岁；10例正常口腔黏膜样本作为对照，其中男3例，女7例，平均年龄（67.7±10.1）岁。

1.2试剂与仪器鼠单克隆抗8-oxodG抗体（日本Fukuroi公司），Alexa 488-标记的山羊抗鼠IgG（美国Molecular Probes公司），鼠单克隆抗P53抗体（美国Sigma公司），共聚焦荧光显微镜（LSM410，德国Zeiss公司）。

1.3实验方法

1.3.1样本制备标本经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制作6µm厚石蜡切片。

1.3.2HE染色石蜡切片常规脱蜡水化，切片在苏木素染液中染色15 min，盐酸乙醇分化15 s，流水冲洗蓝化1 h，伊红染色10 min。切片经脱水透明，然后封片。

1.3.3免疫荧光染色石蜡切片常规脱蜡水化，利用免疫荧光染色检测8-oxodG的免疫反应性。切片在鼠单克隆抗8-oxodG抗体（5µg/ml）4℃孵育过夜；然后在Alexa 488-标记的山羊抗鼠IgG（1∶400）室温孵育2 h。染色后的切片在共聚焦荧光显微镜下观察。

用鼠单克隆抗P53抗体（1∶400）代替8-oxodG抗体，进行免疫荧光染色，检测P53的免疫反应性。

1.4阳性评价所有切片采用双盲法由2位病理学专业教师独立阅片。根据8-oxodG和P53免疫染色阳性细胞数对染色结果进行等级评价：每张切片随机观察3个高倍视野，根据阳性细胞的比率进行评估，阳性细胞百分率＜10%为阴性（-）；阳性细胞百分率10%～50%为弱阳性（+），阳性细胞百分率＞50%为强阳性（++）。

1.5统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，采用卡方检验进行组间比较，采用Pearson相关分析进行相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1口腔黏膜白斑患者的黏膜上皮组织病理学改变HE染色显示口腔黏膜白斑患者口腔黏膜上皮层和上皮下固有层可见炎性细胞浸润，部分患者可见过角化，上皮基底层可见异型性增生（不伴异型性增生患者10例，伴异型性增生患者10例），见图1。

图1　口腔黏膜白斑患者口腔黏膜活检标本（HE染色，×200）

2.28-oxodG在口腔黏膜上皮的表达8-oxodG的免疫阳性见于细胞核，阳性细胞主要分布于上皮基底层，上皮组织与结缔组织邻接处，固有层也可见染成绿色的阳性细胞核，见图2；正常口腔黏膜未见8-oxodG的表达。

2.3P53在口腔黏膜上皮的表达P53免疫反应性分布于细胞核，阳性细胞主要分布于上皮基底层，上皮浅层阳性细胞散在分布，固有层也可见染成绿色的阳性细胞核，见图3；正常口腔黏膜未见P53的表达。

图2　8-oxodG在口腔黏膜白斑中的表达（免疫荧光染色，×200）

图3　P53蛋白在口腔黏膜白斑中的表达（免疫荧光染色，×200）

2.48-oxodG和P53的生成与口腔黏膜白斑的关系

8-oxodG、P53在正常口腔黏膜表达均呈阴性；在口腔黏膜白斑伴或不伴异型性增生患者的口腔黏膜上皮表达阳性率与正常口腔黏膜比较差异有统计学意义（P＜0.01），见表1和表2。Pearson相关分析显示8-oxodG、P53在正常口腔黏膜、口腔黏膜白斑伴或不伴异型性增生的阳性表达程度具有相关性，与病变程度呈正相关（r=0.773，P＜0.01）。

表1　8-oxodG在口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜中表达强度的比较

表2　P53蛋白在口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜中表达强度的比较

3　讨论

本研究显示口腔黏膜白斑患者HE染色图片可见炎性细胞浸润和上皮异型性增生等组织病理学改变，与以前报道［1］一致。8-oxodG作为氧化性DNA损伤标志物在口腔黏膜白斑中生成，免疫阳性细胞见于上皮基底层细胞核。炎症时巨噬细胞和中性粒细胞等炎性细胞可产生O2-，一氧化氮合成酶介导一氧化氮（NO）的生成，NO与O2-反应生成ONOO-，进而导致氧化性DNA损伤，使8-oxodG生成［4］。8-oxodG生成导致DNA中G-T碱基对转换从而参与癌的发生［5］。此外，8-oxodG的阳性表达程度与口腔黏膜白斑患者的病变程度密切相关，具有上皮异型性增生的口腔黏膜白斑患者8-oxodG均强表达。因此，我们推测由活性氧导致的氧化性DNA损伤可能参与口腔黏膜白斑的发生发展过程。本研究首次报道氧化性损伤参与口腔黏膜白斑的发展过程。

本研究结果显示P53在大部分口腔黏膜白斑患者的上皮细胞呈阳性表达，且表达强度与口腔上皮异型性增生的发生密切相关，具有上皮异型性增生的口腔黏膜白斑患者P53表达均强阳性，P53蛋白在口腔黏膜白斑患者的表达与上皮损伤的程度相关，与以前报道［6-7］一致。有报道称高浓度的NO可导致P53蛋白的表达［8］，P53蛋白表达是DNA损伤的重要反应［9-10］，P53在基底层浅部的表达与口腔癌的发生密切相关［11-12］。许多研究认为p53基因的突变是癌发生发展过程中最为普遍的基因现象，免疫组化法检测到的P53蛋白即为突变型P53［13］。口腔黏膜白斑的癌病率为0.19%～19.18%［14］。

总之，氧化性DNA损伤在口腔黏膜白斑的发生过程中起着重要的作用，随着病变程度上皮异型性增生的出现，8-oxodG和P53的免疫阳性表达增强。因此，8-oxodG的生成可作为评价口腔黏膜白斑癌前病变程度的生物指标和口腔癌发生的风险性预测指标。

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（13）；286-287.

Expression of 8-oxodG in Oral Leukoplakia

SU Qiuxiang1，YAO Bo2，WANG Xuguang3，YANG Li4，ZHANG Sujun5，DING Xiaohui6*
（1.Morphology Laboratory，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Department of Stomatology，The 4th People's Hospital of Shenyang；3.Department of Pathology，Shenyang Medical College；4.Department of Stomatology；5.Grade 2012，Class 3；6.Department of Histology and Embryology）

R329

A

1008-2344（2016）05-0325-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.05.002

2016-03-06

（文敏 编辑）

辽宁省教育厅科研课题（No.L2014406）；沈阳医学院大学生课题（No.20150806）

苏秋香（1963—），女（汉），高级实验师，研究方向：形态学方面研究.E-mail：2283800016@qq.com

丁晓慧（1971—），女（汉），教授，研究方向：心脑血管缺血性疾病.E-mail：1285448068@qq.com