壳聚糖/膨润土固定化脂肪酶水解橄榄油的研究

曹　婕　董华平

(绍兴文理学院　化学化工学院，浙江　绍兴321000)



壳聚糖/膨润土固定化脂肪酶水解橄榄油的研究

曹婕董华平

(绍兴文理学院化学化工学院，浙江绍兴321000)

为了改善游离脂肪酶催化稳定性低、难以回收等缺陷，以不同比例的壳聚糖/膨润土复合载体负载脂肪酶，以提高脂肪酶在橄榄油水解中的催化性能.通过红外光谱(FTIR)、扫描电镜(SEM)等对壳聚糖/膨润土复合材料进行表征，并考察了各种壳聚糖/膨润土固定化脂肪酶对橄榄油水解反应的催化性能.结果表明：当壳聚糖与膨润土的质量比为10%(CB-10)时，脂肪酶的负载量达到最高(92.1%)，固定化酶的催化活性为0.56 U/mg，连续反应5批次后，固定化酶的剩余活性为初始值的68.2%，显示了较好的催化稳定性.该研究结果说明，壳聚糖/膨润土复合材料较好地兼顾了无机材料的结构刚性和天然高分子物质的生物相容性，是固定化酶的良好载体.

壳聚糖；膨润土；固定化酶；催化；橄榄油

脂肪酶是一类具有多种催化功能的生物酶，可用于催化水解、酯化、酯交换、醇解等反应[1-3]，在医药、食品、化工、能源和环境保护等领域中得到广泛应用[4-5].然而游离脂肪酶在反应过程中易团聚、难以回收，而且在酸、碱、热和有机溶剂条件下不够稳定，从而制约了脂肪酶在工业中的广泛应用[6].利用固定化酶技术可以提高脂肪酶催化稳定性、重复利用性，有利于实现催化反应的连续化生产[1,7].在脂肪酶固定化技术中，选择合适的载体材料和负载方法是制备高效稳定固定化脂肪酶的关键环节.

膨润土作为一种在我国储藏丰富、价格低廉的天然矿物，具有比表面积大、吸附性能好，特别是它可以通过合适的修饰，得到结构和功能可调的改性膨润土，因而可作为污染物的吸附剂[8]、催化剂的载体[9]和农药的缓释控制[10]等.近年来研究表明：膨润土还可作为生物酶的固定化载体能够提高酶的催化稳定性[11-13]，但由于膨润土致密的层状结构，致使酶负载量较低，此外，膨润土与生物酶的生物相容性也不够理想.为此，本文将具有良好生物相容性的天然高分子物质-壳聚糖[14]与膨润土合适混合，作为脂肪酶的复合载体，以改善载体的结构和分散性能，提高固定化酶的催化性能.

本文重点考察了四种不同混合比例的壳聚糖/膨润土复合载体对脂肪酶负载率的影响，研究了壳聚糖/膨润土固定化脂肪酶在水解橄榄油中的催化活性和重复使用性能.

1　实验部分

1.1实验材料及其仪器

实验所用钠基膨润土购自绍兴市三鼎膨润土开发有限公司；磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、氢氧化钠(NaOH)、无水乙醇、橄榄油、酚酞固体、考马司亮蓝均为分析纯；壳聚糖、脂肪酶购于阿拉丁试剂公司.

主要仪器有NEXUS型傅立叶变换红外光谱仪(美国尼高力仪器公司)；X-射线衍射仪(荷兰帕纳科，Empyrean)；SP-756P型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；SHZ-88A水浴恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)；QL-901型旋涡混合器(江苏海门市麒麟医用仪器厂)；TGL-16G型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)等.

1.2壳聚糖/膨润土复合材料的制备

分别将0.25 g、0.5 g、1.0 g和2.5 g壳聚糖加入到100 mL的醋酸溶液(1%，v/v)中，充分搅拌溶解后，在每份壳聚糖溶液中加入5 g钠基膨润土(使壳聚糖与膨润土的质量比分别达到5%、10%、20%和50%)，在60℃恒温水浴中搅拌12 h，离心分离，用去离子水洗涤至中性，然后经干燥、研磨后过100目筛备用.得到的复合材料分别记为CB-5、CB-10、CB-20和CB-50.

1.3壳聚糖/膨润土固定化酶的制备

将0.1g壳聚糖/膨润土复合材料，分散到5ml 的磷酸盐缓冲液中(pH 6.0)，然后加入一定量的脂肪酶粉末进行混合.在室温条件下，振荡混合4h[15]，离心，去离子水洗涤沉淀除去杂质后，在室温下真空干燥得到壳聚糖/膨润土固定化酶.

1.4脂肪酶负载率的测定

分别将0.1 g 的CB-5、CB-10、CB-20和CB-50和一定量的脂肪酶，加入到5 mL pH=6.0 的磷酸盐缓冲液中，在室温下振荡4h，反应结束后离心，再用2 mL pH=6.0的缓冲液洗涤两次，合并上清液和洗涤液，记录总体积.采用考马斯亮蓝染色法[16-17]，测定上清液和洗涤液中未固定的蛋白量，将总蛋白量减去未固定量得到固定在载体上的酶蛋白量，计算得到脂肪酶负载率.

1.5固定化脂肪酶催化水解橄榄油活性的测定

橄榄油乳化液的配制：称取4 g聚乙烯醇于250 mL l锥形瓶中，加入100mL去离子水，加热搅拌使聚乙烯醇溶解，然后加入30 mL橄榄油，用高速搅拌器搅拌，制得橄榄油乳化剂.

将1.3制得的固定化酶(10 mg)放入50 mL锥形瓶中，加入4 mL pH=7.0的缓冲液和1 mL橄榄油(10%，v/v)，在30℃恒温水浴振荡30 min后，加入5 mL无水乙醇终止反应.以酚酞作指示剂，用0.02 mol/L NaOH溶液滴定至终点，得到所用体积V1[18].按上述相同步骤，测得空白液(未加脂肪酶)所需NaOH体积V2，按下式(1)计算比酶活.酶活定义：在实验条件下，1min内1mg蛋白的脂肪酶催化水解橄榄油所得到脂肪酸的mmol量，定为一个酶活单位，记作1U.

比酶活=(V1-V2)×C×103/(t×10η)

(1)

C为NaOH浓度，t为反应时间n，η为脂肪酶负载率，比酶活单位U/mg.

1.6固定化脂肪酶稳定性实验

在30℃下，以每次固定化脂肪酶催化水解橄榄油(30 min)为一个反应批次.反应结束后，离心得到的沉淀用pH=6.0的磷酸盐缓冲液洗涤三次，然后再加入相同量的橄榄油溶液，再次进行水解反应，依次重复五次.将第一次时固定化酶水解橄榄油的催化活性定为100%，以后每一批反应固定化酶的残余酶活为该批固定化酶的催化活性与第一批固定化酶催化活性的比值[19].

2　结果与讨论

2.1样品的表征分析

图1为壳聚糖/膨润土复合材料的红外光谱，其中3 422.7 cm-1和1 078.5 cm-1的吸收峰属于膨润土层间-OH和Si-O-Si的伸缩振动峰.2 922.1 cm-1和2 877.6 cm-1为壳聚糖分子中-CH2-和-CH-的伸缩振动吸收峰，1 640.2 cm-1和1 562.5 cm-1则为壳聚糖分子中氨基的吸收峰.结果表明：壳聚糖已与膨润土很好复合.

图1　壳聚糖/膨润土的红外光谱图

图2为用扫描电子显微镜(SEM)测得的膨润土和壳聚糖/膨润土复合材料形貌.从图2(a)看到膨润土载体具有比较致密的层状结构(d001=1.23 nm)[14]，不利于脂肪酶等生物大分子的负载.而图2(b)中，膨润土混入壳聚糖后，结构变得疏松，且分散性较好，有利于脂肪酶的固定化.

(a)　　　　　　　　(b)

2.2脂肪酶在壳聚糖/膨润土复合材料上负载率的考察

在壳聚糖/膨润土复合材料制备过程中，不同的壳聚糖与膨润土的比例会影响复合材料的结构，从而影响脂肪酶在载体上的负载率.四种不同的复合载体(CB-5、CB-10、CB-20和CB-50)对载酶率的影响(图3).当加入的壳聚糖达到膨润土质量的10%时，脂肪酶的负载量达到最佳(92.1%)，过低或过高的壳聚糖量得到的复合载体对脂肪酶的负载量都较低.这可能是由于壳聚糖加入量过低会影响膨润土载体的分散性能，而过高的壳聚糖加入量则会占据膨润土载体上的吸附位点，从而影响脂肪酶在复合载体上的负载.

图4为不同的脂肪酶初始浓度下，CB-10对脂肪酶负载率的变化.结果表明，当脂肪酶的初始浓度为5-10 mg/mL时，脂肪酶的负载率较高.而当脂肪酶浓度超过10 mg/mL时，载酶率出现明显下降.由此可知，在载体材料加入量一定的情况下(0.1 g)，由于吸附位点有限，复合载体无法负载过多的脂肪酶分子，从而导致载酶率的下降.

图3　不同比例的壳聚糖/膨润土对脂肪酶载酶率的影响

图4　不同的脂肪酶加入量对壳聚糖/膨润土(CB-10)载酶量的影响

2.3壳聚糖/膨润土固定化酶对橄榄油的催化活性比较

通过比较不同的壳聚糖/膨润土复合材料(CB-5、CB-10、CB-20和CB-50)固定化脂肪酶对橄榄油水解的催化活性(图5)，发现CB-10固定化酶的催化活性为0.56U/mg，均高于其他的壳聚糖/膨润土固定化酶的催化活性.究其原因，除了载酶量较高以外，与CB-10的分散性能较好也有一定的关系.相比之下，虽然CB-20对脂肪酶的负载量高于CB-5(图3)，但CB-20固定化酶的催化活性却比后者要低，这可能与CB-20的分散性能较差有关.

图5　不同壳聚糖/膨润土固定化酶的催化活力

2.4壳聚糖/膨润土固定化脂肪酶的重复使用性能

重复使用性与催化活性是催化剂的两个最重要的性能，我们选取催化活性最高的CB-10固定化脂肪酶，采用1.6的方法，考察该固定化酶的催化稳定性.图6结果显示，连续反应5批次后，固定化酶的剩余活性仍可达到初始值的68.2%，说明该固定化酶的结构较为稳定，从而保证了较好的催化稳定性和重复使用性能.

图6　CB-10固定化脂肪酶的批次稳定性

3　小结

本文将不同比例的壳聚糖与膨润土混合制得可用于负载脂肪酶的壳聚糖/膨润土复合材料.研究结果显示：当加入的壳聚糖质量达到膨润土的10%时，该复合材料(CB-10)对脂肪酶的负载率达到最高，其固定化酶对橄榄油水解反应的催化活性也最佳，说明合适的壳聚糖加入量有利于提高载体对脂肪酶的吸附性能和生物相容性.CB-10固定化酶对橄榄油水解重复反应5次后，仍显示出较高的催化活性，表明该复合材料具有较好的催化稳定性.

[1]K RANANI, R BOOPATHY, C VIDYA, et al. Immobilization of Pseudomonas gessardii acidic lipase derived from beef tallow onto mesoporous activated carbon for the hydrolysis of olive oil [J]. Process Biochemistry, 2010, 45(6):986-992.

[2] YONG YANG,BAI YONGXIAO,LI YANFENG,et al.Characterization of candida rugosa lipase immobilized onto magnetic microspheres with hydrophilicity[J].Process Biochemistry,2008,43(11):1179-1185.

[3]DONG HUAPING,WANG YAJUN,ZHENG YUGUO.Enantioselective hydrolysis of diethyl 3-hydroxyglutarate to ethyl (s)-3-hydroxyglutarate by immobilized candida antarctica lipase b[J].Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,2010,66(1-2):90-94.

[4]SHARMA, ROHIT,CHISTI, et al.Production, purification, characterization, and applications of lipases[J].Biotechnol Adv,2001,19(8):627-662.[5]DAYAN FU,CONG LI,JIKE LU,et al.Relationship between thermal inactivation and conformational change of yarrowia lipolytica lipase and the effect of additives on enzyme stability[J].Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,2010,66(1-2):136-141.

[6]IYER P V,ANANTHANARAYAN L.Enzyme stability and stabilization-aqueous and non-aqueous environment[J].Process Biochemistry,2008,43(10):1019-1032.

[7]ZHAI RUI,ZHANG BING,LIU LIN,et al.Immobilization of enzyme biocatalyst on natural halloysite nanotubes[J].Catal Commun,2010,12(4):259-263.

[8]ZHU LIZHONG,MA JIANFENG.Simultaneous removal of acid dye and cationic surfactant from water by bentonite in one-step process[J].Chemical Engineering Journal,2008,139(3):503-509.

[9] Y M LI, W CHENG, G D SHENG, et al. Synergetic effect of a pillared bentonite support on Se(VI) removal by nanoscale zero valent iron [J]. Applied Catalysis B: Environmental. 2015, 174: 329-335

[10]JIANFA LI, YIMIN LI, HUAPING DONG.Controlled release of herbicide acetochlor from clay/carboxylmethylcellulose gel formulations[M],2008:1336-1342.

[11]GHIACI M,AGHAEI H,SOLEIMANIAN S,et al.Enzyme immobilizationpart 1. modified bentonite as a new and efficient support for immobilization of candida rugosa lipase[J].Appl Clay Sci,2009,43(3-4):289-295.

[12]GHIACI M,AGHAEI H,SOLEIMANIAN S,et al.Enzyme immobilization: part 2:immobilization of alkaline phosphatase on na-bentonite and modified bentonite[J].Appl Clay Sci,2009,43(3-4):308-316.

[13]YESILOGLU, YESIM.Utilization of bentonite as a support material for immobilization of candida rugosa lipase[J].Process Biochemistry,2005,40(6):2155-2159.

[14]马勇，王恩德，邵红.膨润土负载壳聚糖的脱色处理[J].环境科学与技术，2004,27(1)：13-14.

[15]赵海峰．传统的酶固定化法及改进方法[J].医药化工，2007(2):24-26.

[16]李小冬,吴嘉,贾东晨,等.固定化酶的研究方法概述[J].中国酿造,2011(11):5-9.

[17]李娟,张耀庭,曾伟,等.应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J].中国生物制品学杂志,2000(2):118-120.

[18]杨莹琴，陈慧娟．羧甲基壳聚糖插层膨润土的研制及其对Cu+的吸附[J].化学化工，2009,32(1):33-35.

[19]H P DONG, J F LI, Y M LI, et al. Improvement of catalytic activity and stability of lipase by immobilization on organobentonite [J]. Chemical Engineering Journal, 2012(181):590-596.

(责任编辑王海雷)

On Hydrolysis of Olive Oil by Immobilized Lipase on Chitosan/Bentonite Carrier

Cao JieDong Huaping

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Shaoxing University, Shaoxing, Zhejiang 312000)

In order to solve the low catalytic stability, difficult recovery and other issues of free lipase, we tried to choose the different ratio of chitosan/bentonite as the carrier of lipase to improve its activity in the hydrolysis of olive oil. The chitosan/bentonite composites were characterized by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Scanning Electron Microscopy (SEM), and the catalytic properties of immobilization lipases on various chitosan/bentonite in the hydrolysis of olive oil were studied. The results show that 10% of the mass ratio of chitosan and bentonite (CB-10) can achieve the best immobilization yield of lipase (92.1%) on the carrier, and the catalytic activity of the immobilized enzyme is 0.56U/mg. The residual activity of the immobilized enzyme is 68.2% after 5 consecutive batches of the reaction, showing good catalytic stability. The research findings indicate that the chitosan/bentonite composite which can make a better balance between the structural rigidity of the inorganic material and the biocompatibility of the natural polymer material is a good carrier of the immobilized enzyme.

chitosan; bentonite; immobilized enzyme; catalysis; olive oil

2016-05-03

浙江省公益技术研究社会发展项目(编号：2015C33229)

曹婕(1990-)，女，安徽安庆人，硕士研究生，主要从事环境功能材料研究.通讯作者：董华平，博士，副教授，E-mail：olive 180@163.com

10.16169/j.issn.1008-293x.k.2016.08.14

X791

A

1008-293X(2016)08-0077-05