Twist和ZO-1在卵巢癌中的表达及其与卵巢癌发生发展的相关性研究

刘　平　程栋梁　袁玲玲

·临床研究·

Twist和ZO-1在卵巢癌中的表达及其与卵巢癌发生发展的相关性研究

刘平程栋梁袁玲玲

目的 研究Twist和ZO-1在卵巢癌和正常卵巢组织中的表达及其分布特点，并探讨二者在卵巢癌表达中的相关性及其与肿瘤发生发展的关系。方法 采用免疫组织化学方法（SP法）检测卵巢癌患者手术切除标本癌组织及正常卵巢组织中Twist和ZO-1的表达水平，并与肿瘤的分级和分期进行统计学分析。结果 Twist在卵巢癌组织中阳性表达率（76.0%，38/50）高于正常卵巢组织（20.0%，4/20），差异有统计学意义（P＜0.05）；ZO-1在卵巢癌组织中阳性表达率（32%，16/50）低于正常组织（85.0%，17/20），差异有统计学意义（P＜0.05）；Twist和ZO-1的表达水平在卵巢癌的不同分级和分期中的表达差异有统计学意义（P＜0.05）；二者在卵巢癌中的表达呈负相关（r=-0.76，P＜0.05）。结论 Twist和ZO-1在卵巢癌组织中表达的变化可能与肿瘤的发生发展有关；Twist和ZO-1联合检测可作为评估卵巢癌转移与预后的指标。

卵巢癌 Twist ZO-1 表达

卵巢上皮性癌的病死率长期居于妇科恶性肿瘤的第一位［1］，对女性健康危害较大，这与其较高的侵袭力和转移力、耐药性以及复发率等一系列生物学行为密切相关。因此，研究卵巢癌的发病机制以及侵袭、转移的关键环节，对于提高卵巢癌患者的总体疗效、改善和评估其预后具有重要意义。研究发现上皮-间质转化（epithelial- mesenchymal transitions，EMT）在肿瘤侵袭和转移中起关键作用［2-4］，Twist是参与EMT的重要转录因子之一，在人体众多上皮来源的恶性肿瘤中均存在Twist 基因突变，且与恶性肿瘤的浸润、转移及预后密切相关。本研究以卵巢癌为观察对象，采用免疫组化方法检测卵巢癌中Twist与OZ-1等表达情况，从而探讨卵巢癌转移机制，为改善卵巢癌预后提供研究方向及实验基础。

1　材料与方法

1.1一般资料 本研究观察组标本来自本院病理科自2011年1月至2013年9月期间确诊为卵巢癌的蜡块标本共50例，均为原发性肿瘤，标本切去前均未行放化疗或激素治疗。收集同期因子宫脱垂或子宫肌瘤行全子宫及卵巢切除的病例20例作为对照组，对照组卵巢标本经本院病理证实为正常卵巢组织。两组标本年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。观察组标本根据WHO分级标准将其分为2级：高级别21例、低级别29例。按 FIGO分期标准进行分期：Ⅰ期9例、Ⅱ期21例、Ⅲ期16例、Ⅳ期4例。

1.2试剂 兔抗人Twist单克隆抗体购自英国Abcam公司，按1∶100 工作浓度的体积浓度进行稀释后使用。浓缩型兔抗人ZO-1多克隆抗体购自BD公司。浓缩型 DAB 试剂盒、SP免疫组织化学染色试剂盒等常规试剂购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.3方法 标本经常规甲醛固定、包埋，制作蜡块，用于免疫组织化学染色。Twist的检测实验采用SP两步免组化的方法，具体实验方法参考说明书进行，以磷酸盐缓冲液（PBS）一抗作为阴性对照，用已知阳性结果作为阳性对照。ZO-1的检测采用链霉亲和素-生物-过氧化物酶复合物法（SABC法），ZO-1抗体工作浓度为1：50。

1.4结果判断 由两名高年资病理科医师按照独立双盲的原则进行读片。Twist蛋白主要表达于细胞质中，呈现清晰的棕黄色或棕褐色表达为阳性表达，细胞内无黄色或与背景一致的浅黄色为阴性。采用半定量法读片，染色强度分为0分（阴性）、1分（弱阳性）、2分（中等）和3分（强阳性），染色范围分为0分（0%）、1分（1%～10%）、2分（11%～50%）、3分（＞50%），根据染色强度和染色范围之和作为染色最终结果，＜3分为Twist表达阴性，≥3分为阳性［5］。ZO-1蛋白主要表达于细胞膜和细胞浆中，以胞膜和胞浆中出现黄色颗粒者为阳性。每张切片阳性细胞的染色强度分为无着色（0分）、淡黄色（1分）、棕黄色（2分）、棕褐色（3分）。在200倍的显微镜视野下随机选取5个视野，计算阳性细胞数，＜5%（0分）、5%～24%（1分）、25%～50%（2分）、51%～75%（3分）、＞75%（4分）。根据染色强度和阳性细胞数评分之和作为染色最终结果，0～4分为阴性表达（-），≥5分为阳性（+）。

1.5统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Twist和ZO-1蛋白在卵巢上皮癌与正常卵巢组织的表达 免疫组化染色显示，Twist蛋白主要表达于细胞质中，呈现清晰的棕黄色或棕褐色；ZO-1蛋白主要表达于细胞膜和细胞浆中，典型阳性者呈黄色颗粒状（图1～4）。

2.2Twist和ZO-1蛋白在卵巢上皮癌与正常卵巢组织中表达的比较 本组50例卵巢癌组织标本中有38例Twist蛋白表达阳性，阳性表达率为76%；20例正常卵巢组织标本有4例Twist蛋白表达阳性，阳性表达率20%；两组样本差异有统计学意义（P＜0.05）。50例卵巢癌组织标本中有16例ZO-1蛋白表达阳性，阳性表达率为32%；20例正常卵巢组织标本有17例ZO-1蛋白表达阳性，阳性表达率85%；两组样本差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

图1　Twist在卵巢癌组织中的表达［×200（阳性）］

图2　Twist在正常卵巢组织中的表达［×200（阴性）］

图3　ZO-1在卵巢癌组织中的表达［×200（阴性）］

图4　ZO-1在正常卵巢组织中的表达［IHC×200（阳性）］

表1　卵巢癌组织与正常卵巢组织中Twist和ZO-1蛋白的表达［n（%）］

2.3Twist和ZO-1蛋白表达与卵巢上皮癌临床病理特征的关系 Twist蛋白在高级别肿瘤和分期晚的卵巢癌组织中的表达高于低级别肿瘤和分期早的卵巢癌组织（P＜0.05）。ZO-1蛋白在卵巢癌组织中的表达则与之相反，其在高级别肿瘤和分期晚的卵巢癌组织中的表达明显低于低级别肿瘤和分期早的卵巢癌组织（P＜0.05）。见表2。

表2　Twist和ZO-1蛋白的表达与卵巢癌临床病理特征的关系

2.4Twist和ZO-1蛋白在卵巢上皮癌组织中表达的相关性分析 38例Twist蛋白表达阳性的卵巢癌组织中ZO-1蛋白表达阳性者5例，表达阴性者33例；而在Twist表达阳性的16例卵巢癌组织中ZO-1蛋白表达阳性者5例，表达阴性者11例；相关分析结果提示卵巢组织中Twist蛋白表达与ZO-1蛋白表达呈负相关（r=-0.76，P＜0.05）。

3　讨论

卵巢癌是起源于正常卵巢表面上皮（OSE）或内衬 OSE 的包涵囊肿，约占卵巢恶性肿瘤的 90%，是女性生殖器官中常见的肿瘤之一，发病率次于子宫颈癌和子宫体癌列居第3位，但病死率长期位居妇科恶性肿瘤之首，对女性健康危害极大。虽然目前治疗卵巢癌有手术、放化疗及介入治疗等多种方法，但对晚期患者总体疗效欠佳。所以，开展卵巢癌病理特点和分子生物学的研究与探索对于干预卵巢癌的发展和评估卵巢癌的预后具有重要意义。

EMT的概念最早由哈佛大学Hay等提出，后经证实在较多物种胚胎形成、神经嵴形成等过程中存在的一种现象，主要指上皮细胞经历了短暂的结构改变后，表型与细胞形态发生改变，从而获得迁移与运动能力；后来发现在细胞转化、肿瘤的浸润转移过程中也存在类似现象。正是因肿瘤进展过程中的EMT，才使得肿瘤细胞获得浸润周围组织的能力，从而发生远处转移，形成真正意义上的恶性肿瘤。

Twist是近年发现的一个癌基因，有研究显示［6］，Twist在EMT过程中发挥重要的调控作用。通过进一步深入的研究，国内学者也发现［7］，Twist参与了宫颈癌、卵巢癌等恶性肿瘤的侵袭和转移过程，与肿瘤的预后密切相关。本研究显示，卵巢癌组织中Twist蛋白的表达明显高于正常卵巢组织，且癌组织分化程度越低，分期越晚，Twist蛋白表达越高。细胞连接蛋白OZ-1的表达则正好相反：卵巢癌组织中OZ-1 蛋白的表达低于正常卵巢组织，且随着肿瘤的进展呈下降趋势。进一步研究发现，在无放化疗和激素等干预措施的情况下，Twist蛋白表达上升的同时OZ-1的表达下降，二者在卵巢癌中的表达存在负相关性。

ZO-l是第1个被证实的紧密连接（fight junction，TJ）附着蛋白，研究表明［8］，TJ的结构破坏和功能的改变，与多种上皮细胞恶性肿瘤的发生、发展相关联，可能是肿瘤转移的关键环节。关于ZO-1蛋白在肿瘤转移中所发挥的作用的研究较少，国内学者郭兴军等［9］的研究显示，TJ蛋白Z0-1在胆管癌中的表达较正常组织明显减少，认为ZO-1在胆管癌组织中的表达与胆管癌的发生和转移密切相关。本资料也得到了相似的结论，在正常卵巢组织中ZO-1蛋白高表达，而在卵巢癌组织中ZO-1蛋白低表达，且其表达与卵巢癌的病理分期和分化程度具有显著相关性。

［1］Aletti GD，Gallenberg MM，Cliby WA，et al. Current management strategies for ovarian cancer. Mayo Clin Proc， 2007，82（6）：751-770.

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［5］Hosono S，Kajiyama H，Terauchi M，et al.Expression of Twist increases the risk for recurrence and for poor survival in epithelial ovarian carcinoma patients.B RJ Cancer，2007，96（2） ： 314-420.

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［9］郭兴军，王敏，江建新，等.ZO-1和Claudin-1在胆管癌中的表达及其意义.中华实验外科杂志，2014，31（8）：1739-1741.

Objective To investigate the expression and distribution of Twist and ZO-1 in epithelial ovarian cancer and to explore the correlation between Twist and ZO-1 in ovarian cancer. Methods lmmunohistoehemical method（SP method）was used to detect the expression of Twist and ZO-1 in 50 cases of ovarian cancer tissue and 20 cases of normal tissue of patient.The clinicopathologic characteristics and tumor staging were statistically analyzed. Results The positive rate of Twist was76.0%（38/50）in ovarian cancer，20.0%（4/20）in the normal tissue of other patients，There were signifi cant differences（P＜0.05）.The positive rate of ZO-1 was 32.0%（16/50）in ovarian cancer，signifi cantly lower than that in the normal tissue 85.0%（17/20）（P＜0.05）.The expression of Twist and ZO-1 were associated with tumor staging and grading in ovarian cancer patients（P＜0.05）. There was a negative correlation between the expression of Twist and ZO-1 in ovarian cancer patients. Conclusions The the high express of Twist and low express of ZO-1 may be concerned with the genesis and the development of human epithelial ovarian cancer.The combined detection of Twist and ZO-1 expression may be used in assessing the metasasis and predicting the clinical prognosis of adenocarcinoma ovarian cancer.

EOC Twist ZO-1 Expression

湖北省十堰市太和医院院级基金项目（2014JJXM0024）

442000 湖北省十堰市太和医院病理科