丝素蛋白取向电凝胶仿生诱导羟基磷灰石复合物合成的实验研究

谢雪梅　葛自力

·实验研究·

丝素蛋白取向电凝胶仿生诱导羟基磷灰石复合物合成的实验研究

谢雪梅葛自力★

目的 用丝素蛋白取向电凝胶作为模板在模拟体液中仿生诱导羟基磷灰石的合成，并系统研究不同浓度的取向电凝胶和预钙化温度对所合成材料的表面形貌和钙磷摩尔比的影响。方法 制取三种不同浓度具有一定取向性的丝素蛋白电凝胶，经过预钙化3次后分别放入模拟体液中静置24h，并研究不同预钙化温度下复合材料表面的形貌特征变化。结果 通过改变取向电凝胶浓度和改变预钙化温度，与未经过电场作用的类凝胶仿生矿化诱导生成的羟基磷灰石比较，表面形貌发生了明显的变化。并对所得材料进行测试表征，复合材料的钙磷摩尔比与人体骨组织和牙体硬组织非常接近。结论 以丝素蛋白取向电凝胶作为模板，钙磷离子在精确的调控和引导下，所制备的复合材料在组成、结构上及形态上与人体骨组织和牙体硬组织相似。有望为组织工程、整形外科和牙科领域提供一种性能优良的修复材料。

丝素蛋白 取向电凝胶 羟基磷灰石

羟基磷灰石［Ca10（PO4）6（OH）2］（HA）是人体坚硬组织中（骨骼和牙齿）的主要无机成分［1-2］。人工合成的HA不仅在成分上与人体组织相同，而且在结构上也与人体组织相似，植入人体内后，在体液作用下，钙、磷会游离出材料表面，被机体组织所吸收，并长出新的组织［3］，具有良好的生物相容性和生物活性，能与人体骨组织形成化学键结合［4］，并产生骨传导作用，是理想的硬组织替代材料，近20多年来已广泛应用于整形外科和牙科领域［5-7］。天然蚕丝蛋白SF（丝素蛋白）具有独特的机械性能、生物活性、良好的生物相容性和生物可降解性，且植入人体后不会产生免疫反应等特性。丝素蛋白可以诱导无机矿物盐离子在其表面沉积，如在人体仿生环境下诱导碳酸钙、HA等晶体的形成，并且矿化后的复合材料是一种良好的骨移植材料。

1　材料与方法

1.1取向SF纤维电凝胶 量取一定量0.5wt%、1.25wt%、2wt%类凝胶，分别置入电泳槽内（排尽类凝胶内空气，尽量减少气泡）类凝胶置入高度正好与电泳槽边缘高度平齐，两端接上直流电压电极，电泳时间20min。

1.2模拟体液（SBF）的制备 见表1。

表1　制备SBF*的试剂

1.3预钙化溶液的制备 （1）0.2mol/l氯化钙溶液的制备：称取1.1098g无水氯化钙溶于40ml超纯水中，同时用磁力搅拌器促进溶解，待完全溶解后，用Tris碱和1 M-HCl将pH值调整至7.4再注入超纯水至50ml，即得到浓度为0.2M CaCl2溶液。（2）0.12mol/L磷酸氢二钾溶液的制备：称取1.3694g K2HPO4·3H2O溶于40ml超纯水中，同时用磁力搅拌器促进溶解，待完全溶解后，再注入超纯水至50ml，即得到浓度为0.12M K2HPO4溶液。

1.4取向丝蛋白纤维仿生诱导SF/HA的合成 （1）取向电凝胶的预钙化处理：将三种浓度（0.5%、1.25%、2%）的取向电凝胶分别进行预钙化处理，预钙化液温度为10℃。首先将取向电凝胶放入0.2M CaCl2溶液中放置1min后取出，用超纯水清洗取向电凝胶，自然晾干。然后再将取向电凝胶放入0.12M K2HPO4溶液中放置1min后取出，仍用超纯水清洗，自然晾干。将上述操作以此交替进行处理3次。将1.25%取向电凝胶进行预钙化处理，预钙化液温度设置为25℃和37℃。其余操作方法同前。（2）预钙化取向电凝胶的仿生矿化：将上述所得预钙化取向电凝胶放入SBF中进行仿生矿化处理，反应温度为37℃。将预钙化取向电凝胶放入SBF中静置24h，24h后取出用超纯水清洗5遍进行去盐处理，然后对材料进行冻干，即得材料取向电凝胶SF/HA。

1.5材料表征 采用扫描电镜（SEM）、X-射线衍射（XRD）、红外吸收光谱（FTIR）、原子发射光谱仪（ICP）分析。

2　结果

2.1不同浓度内凝胶所得取向电凝胶SF/HA结果 （1）FTIR分析：图1中的a、b、c曲线分别为内凝胶、内凝胶/HA、1.25%取向电凝胶/HA的红外光谱，所有样品均在预钙化温度为10℃和SBF（37℃）条件下制备。产物的化学组分由红外光谱进行表征，图中b、c曲线606cm-1、563cm-1处是HA中PO43-的O-P-O键的弯曲振动引起的吸收光谱，谱中1034cm-1、1098 cm-1、961cm-1处是P-O的伸缩振动的吸收谱带，631cm-1、1619cm-1至1659cm-1处的谱带是OH-的特征谱带［8］。c曲线中1034cm-1峰强度明显比b曲线强。（2）XRD分析：图2中的结果显示对照样品在衍射角为25.9°、31.7°两处出现较强的衍射峰，这些衍射峰位置分别对应：HA标准卡上的（002）、（211）晶面，表明该产物的成分为HA。其均为峰形较宽、强度低、不尖锐的衍射峰，表明该材料的HA结晶度比较低［9］。（曲线b，c所示）。b、c曲线在25.9°、31.7°比a曲线峰强，同时在222、213、004晶面也比a强，且随着浓度的增大而增强，说明磷酸盐在其表面的沉积量增加。在2θ=25.9°时的峰强度依次增强，说明HA在丝素蛋白表面取向生长呈c轴优先生长。（3）SEM分析：图3中的a图片为类凝胶的扫描电镜图，表面平滑且致密。b图为取向电凝胶的扫描电镜图。c～f均是经预钙化和SBF（人体仿生液）矿化后所形成的产物。内凝胶经仿生矿化后，只有少量球形结构的羟基磷灰石沉积，颗粒大小不一，分布也不均匀，球表面较光滑；d～f为浓度逐渐增大的扫描电镜图，随着浓度的增加，其HA的形貌发生了一系列的变化。在0.5%取向凝胶/HA中，颗粒的排列明显不同于内凝胶/HA，沉积的羟基磷灰石数量增多，颗粒稍变小，但相互之间出现了交联。在1.25%取向凝胶/HA中，颗粒变得更小，有少量交联转变为多孔互穿网络状结构。在2%取向凝胶/HA中，羟基磷灰石形态发生了大的变化，由颗粒状转变为片状。图c中形成的HA少。图def，经过电场作用，使裸露的羧基数目增加，形成的晶核增加，致模拟体液中释放的钙离子多，诱导沉积的磷酸盐增多。取向电凝胶经预钙化和仿生矿化后磷酸盐均匀沉积在其表面。从图4a、b、c、d中可以看出，其形貌变化不大，只是同等放大倍数下，随着浓度的增大，颗粒变得更小，有少量交联转变为多孔互穿网络状交联结构。e、f为2%取向电凝胶/HA，形成的晶核在增多，沉积的磷酸盐也在增多，最终导致堆积明显，晶体之间相互交联成片状，其分布仍比较均匀。（4）ICP分析：内凝胶仿生所得材料中的钙磷摩尔比低于取向电凝胶，且仅有1.60；而取向电凝胶随着浓度的增加和预钙化温度的增加，钙磷摩尔比也逐渐增加，最高达1.67，与羟基磷灰石中的钙磷摩尔比（1.67）一致。

图1　红外光谱［预钙化10℃SBF37℃。a：类凝胶；b：类凝胶/HA；c：1.25%取向凝胶/HA］

图2　X R D衍射图谱［预钙化10℃SBF37℃。A：类凝胶/HA；b：0.5%取向凝胶/HA；c：2%取向凝胶/HA］

图3　在预钙化温度10℃和SBF（37℃）中矿化后的表面形貌［a：纯内凝胶×50k；b：取向电凝胶×50k ；c：内凝胶/HA ×50k；d：0.5%取向凝胶/HA ×50k；e：1.25%取向凝胶/HA ×50k；f：2%取向凝胶/HA×50k］

2.21.25%取向凝胶在不同预钙化温度所得1.25%取向电凝胶SF/HA （1）FTIR分析：在1645cm-1（酰胺Ⅰ）、1540cm-1（酰胺Ⅱ）和1234cm-1（酰胺Ⅲ）三处均有吸收峰；在1034cm-1、604cm-1、561cm-1三处出现PO43-的吸收峰，并且谱中1034cm-1处的吸收峰强度随着预钙化温度的升高而增强。（2）XRD分析：随着预钙化温度的升高，位于2θ=25.9℃、31.7℃、40.4℃处的衍射峰强度增强，而丝素蛋白的衍射峰未消失。（3）SEM分析：图4cd为1.25%取向电凝胶在预钙化温度10℃和SBF（37℃）条件下仿生矿化后所得材料的SEM图。由图可见，有磷酸盐沉积在取向电凝胶表面，且为球形结构，球与球之间多孔互穿网络状交联结构。在预钙化温度25℃条件下，有较多磷酸盐均匀沉积在取向电凝胶表面，且片状结构，片状结构之间相互交联。当预钙化温度达到37℃时，有大量磷酸盐均匀沉积，也呈片状结构，只是同等倍数下，同等视野范围内磷酸盐的数量更多，片状结构体积变小，相互之间交联更加有规律，形成规则多孔的簇状结构。

图4　不同浓度（ab0.5%、cd1.25%、ef2%）取向电凝胶/HA 在预钙化温度10℃和SBF（37℃）中矿化后的表面形貌（a、c、e×30k，b、d、f×50k）

3　讨论

近年来HA制备方法的研究主要集中在HA纳米结构的控制。常用的制备方法包括干法、湿法和水热法。生物矿化指生物体在一定的环境条件下构筑基于无机矿物的分级结构的过程。生物矿化过程受到溶液状态、生物大分子以及引导矿物成核和生长的基质等一系列生物环境的高度调控，显示出对无机晶体的成核、形貌及结晶学定向等控制力。SF分子作为生物矿化的有机模板已广泛证实，丝素蛋白中-COO-对于矿化起着重要的作用，能够诱导碳酸钙、磷酸钙的矿化，为无机物在其表面矿化提供模板，同时诱导无机离子沉积，在分子水平上控制着无机晶体的成核、生长、形貌、尺寸和取向，对于无机晶体的生长起着模板和调控的作用。本研究的创新之处在于以下四点：（1）提出了一种全新的SF自组装的机制，通过电场处理调控，从而获得具有一定取向性的规则结构的SF取向电凝胶。（2）无须高温烧结和调节pH，近中性条件下合成HA。（3）以SF取向电凝胶作为模板在SBF中仿生诱导HA的合成，调控HA生物矿化，制备出SF取向电凝胶/HA复合材料，且HA晶体在其表面沿c轴取向生长。所制备的复合材料在组成、结构上及形貌上与人体骨组织和牙体硬组织相似。（4）通过改变取向电凝胶浓度（0.5wt%、1.25wt%、2wt%）和预钙化温度（10℃、25℃、37℃），观察复合材料表面的形貌特征变化得知：取向电凝胶更有利于HA沉积。在相同的条件下，温度越高，形成的COOCa+和（-COO）2Ca越多，在SBF中释放的钙离子就越多，形成的HA就越多；浓度增高形成的晶核增多，沉积的磷酸盐也在增多，晶体之间相互交联成片状，其分布仍比较均匀。表面形貌也有小球形结构向三维多孔片状结构转变，而SF的结构并未破坏。

当然也存在一些不足之处，本课题研究的SF/HA力学性能较低，有望在增强力学性能方面作进一步研究。计划进一步行细胞实验和动物学实验学研究，研究该复合材料对大面积颌骨缺损的修复重建是否具有重要意义。

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Objective In the present study，we used the silk fi broin gel in orientation as template to induce the synthesis of hydroxyapatite in SBF. We have investigated the influence of different concentrations and pre-mineralization temperature on the surface appearance and calcium/ phosphorous ratio. Methods Three kinds of different concentrations silk fi broin gel in orientation were prepared by electrophoresis which were put into pre-mineralization water for three times and into SBF for 24h. We had investigated the infl uence of different kinds of preminilization temperature on the surface appearance. Results The surface appearance transform three-dimensional hole lamellar structure from small-sphere compared with silk fi broin gellike hydroxyapatite. The structure and surface appearance of the apatite were investigated by FTIR，XRD，SEM and ICP. The Results show that the HA crystal grows along the c-axes with increase of the concentration and preminilization temperature. And the HA morphology in the form of self-assembled on the gel surface transferred to three-dimensional hole lamellar structure. Conclusion The silk fi broin gel in orientation was used as template in the study， then calcium and phosphonium ions nucleation and growth on surface of silk fi broin gel in orientation，The composite material are similor to bones and teeth on composition，structure and morphology. So，the silk fi broin gel in orientati-on/HA will take important part in providing a high performance repair material for tissue engineering，plastic surgery and dental fi elds.

Silk fi broin Silk fi broin gel in orientation Hydroxyapatie

201411 上海市奉贤区奉城医院口腔科