丰富康复训练对脑出血大鼠Slit2表达的影响

王风波　唐明薇　王琼芬　李　飞　张　弘

(成都医学院第一附属医院康复医学科，四川　成都　610500)



丰富康复训练对脑出血大鼠Slit2表达的影响

王风波唐明薇王琼芬李飞张弘

(成都医学院第一附属医院康复医学科，四川成都610500)

目的观察大鼠脑出血后同侧海马区Slit2的表达情况及丰富康复训练的干预效果。方法将66只成年SD大鼠随机分为对照组、模型组，采用Ⅶ型胶原酶制备诱导尾状核出血模型，模型组又随机分为非干预组和丰富康复训练组，丰富康复训练组大鼠于造模成功次日开始进行干预，各组大鼠分别于24 h、7 d、14 d及21 d时相点行出血侧海马区免疫组化Slit2检测。结果与对照组相比，非干预组、丰富康复训练组大鼠Slit2阳性反应明显增强(P<0.01)，丰富康复训练组Slit2表达水平明显高于非干预组(P<0.01)，各组Slit2阳性反应均以第7天最为显著。结论丰富康复训练能显著增强脑出血大鼠Slit2的阳性表达，促进中枢神经系统的修复与再生。

丰富康复训练；脑出血；Slit2

脑卒中后中枢神经系统的重塑、修复与再生一直是神经康复学研究的热点，其影响因素十分复杂，既有神经生长因子、轴突导向因子等促进因素，又有轴突生长抑制因素，如何有效降低抑制因子作用，提高神经生长促进因素效应，对脑损伤后的修复具有重要意义。作为近年来发现的在神经生长和神经元迁移方面都具有重要作用的轴突导向因子Slit2，目前基础研究主要集中于脊髓损伤和非出血性脑损伤，国内外尚未见到有关脑出血后Slit2表达变化的研究报告，而丰富康复训练对其影响更是未知。本研究观察大鼠脑出血后同侧海马区Slit2的表达情况，探讨丰富康复训练在脑出血康复治疗中的作用。

1　材料与方法

1.1材料66只SD成年雄性大鼠，体重均≥220 g，由成都大学动物实验中心提供；Ⅶ型胶原酶(Sigma公司)；大鼠脑立体定位注射仪(江湾Ⅰ型)；微量注射器(上海高鸽)；动物颅骨钻(ALC-CED)；兔抗大鼠Slit2抗体及(SABC)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2方法大鼠随机分为对照组(n=24)、模型组(n=42)，模型组又分为非干预组(n=24)和丰富康复训练组(n=18)，均常规饲养。参照Rosenberg等〔1〕及杨洁等〔2〕方法制备Ⅶ型胶原酶诱导尾状核脑出血大鼠模型：水合氯醛腹腔麻醉大鼠后固定于脑立体定位仪上，充分暴露前囟，取前囟后0.5 mm，矢状线右旁侧3 mm，动物颅骨钻钻孔。Ⅶ型胶原酶0.6 U溶于1.5 μl生理盐水，微量注射器进针至硬膜下约5 mm并缓慢给药，注射时间不超过5 min，注射完毕留针8 min，缓慢退针后缝合头皮。造模全程要求无菌操作。对照组手术操作方法同模型组，注射同等剂量生理盐水代替胶原酶。术后24 h随机处死对照组和非干预组大鼠各6只，行肉眼及显微镜下观察脑出血区情况，并用免疫组织化学法检测Slit2表达。丰富康复训练组大鼠于造模次日开始进行干预。各组大鼠分别于第7、14及21天时相点行脑出血侧海马区脑组织免疫组化Slit2检测。

1.3丰富康复训练

1.3.1早期触摸造模成功后次日开始将丰富康复训练组大鼠托至掌心，用软毛刷从头至尾刷动，匀速有力，持续15 min/次，1次/d，至第7天。

1.3.2丰富环境刺激第7天开始将丰富康复训练组大鼠暴露于丰富环境中，包括：转盘、秋千、摇铃、管道、爬梯、阶梯等，同时给予声音和彩色灯光刺激，每周更新两次环境刺激。2 h/d，1次/d，至第14天。

1.3.3康复训练从第7天开始对丰富康复训练组大鼠进行康复训练，1次/d，至第21天。包括:①跑笼训练:采用圆形转笼，底座有固定架，大鼠在其内奔跑，10 min/次；②平衡木训练:平置距地面50 cm处，让大鼠在上面行走，10 min/次；③网屏训练：网屏距地面高度为80 cm，下方铺以海绵，训练期间观察大鼠是否会用前爪抓住网屏或从网屏上掉下，10 min/d。

1.4出血侧海马区Slit2免疫组织化学检测免疫组织化学染色用SABC法，阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。光镜下观察神经元胞核周围胞质有棕黄色颗粒为阳性表达。每例脑组织取4张切片，所有切片均在400倍显微镜下随机拍取4个互不叠加的视野，计数阳性细胞，取其平均值。

1.5统计学方法采用SPSS17.0软件进行t检验、q检验及秩和检验。

2　结　果

2.1肉眼及镜下观察大鼠脑组织病理改变造模成功后24 h随机处死对照组和模型组大鼠各6只，以冠状面切开进针点脑组织，模型组大鼠右侧尾状核部位可见血肿形成，直径约2.5 mm，血肿周边有不规则的水肿带，光学显微镜下可见脑内注射区大量红细胞渗出聚集，脑神经元大量坏死，其间少许散在存活神经元，血肿周边有小胶质细胞与中性粒细胞浸润，出血区内有大量呈黄褐色的含铁血黄素颗粒。对照组大鼠脑内无血肿形成。

2.2各组大鼠脑出血侧海马区Slit2免疫组化检测情况对照组右侧海马区可见少量Slit2阳性细胞散在分布。脑出血后，Slit2阳性表达水平明显升高，与对照组相比，非干预组、丰富康复训练组出血侧海马区Slit2阳性细胞计数显著上升(P<0.01)；与非干预组比较，丰富康复训练组大鼠Slit2阳性反应进一步增强(P<0.01)。非干预组与丰富康复训练组不同时间点比较均有显著差异(P<0.01)。各组Slit2阳性反应均以第7天最为显著。见表1和图1。

表1　各组大鼠海马区Slit2阳性细胞计数比较

与对照组比较：1)P<0.01；与非干预组比较：2)P<0.01

图1　各组第7天Slit2免疫组在检测大鼠脑出血测海马区(DAB，×400)

3　讨　论

Slit家族是近年来发现的在神经生长和神经元迁移方面都具有重要的导向作用的分泌型蛋白质分子，与表达在轴突表面的受体相互作用，对轴突生长起着排斥性导向作用，引导生长锥朝正确的方向延伸，并决定这些轴突是否穿过中线，或阻止已经穿过中线的轴突迂回〔3〕。Slit的导向作用主要依赖于其浓度梯度而非绝对量。Slits因子分布于成年脑的皮质、海马、小脑等区域，提示Slits可能在成年脑内发挥某些功能，而成年脑内鲜有轴突诱导现象发生。出生后发育期脑内的Slits和Robo因子表达水平上调并维持在较高的水平，说明Slits的功能不但体现在调控轴突生长和神经元迁移方面，而且极有可能参与了突触的塑形〔4〕。已观察到的海马组织不断改变连接现象，就可能与Slits参与的神经活性的改进有关。有学者〔5〕用原位杂交研究冷凝损伤的脑组织内Slit-mRNA表达情况，发现所有的Slit-mRNA在坏死区均有不同程度的表达，其中Slit2 mRNA在病灶区周围脑组织的胶质细胞表达最为明显，认为Slit2可能产生阻止再生轴突进入病灶的作用，从而成为影响中枢神经再生的原因之一。尽管成年脑内Slit2的表达明显减少，但在中枢神经系统损伤情况下，多种轴突导向因子及相应受体的表达可再次发生改变，并从多个方面抑制轴突再生〔6〕。有研究用液氯针刺伤成年大鼠脑组织，发现损伤后第7天损伤灶周围脑组织多种Slit阳性表达，并以Slit2表达水平最高〔7〕。目前认为Slits的功能主要表现在：①对轴突生长的排斥性导向作用；②引导神经细胞的运动；③促进背根神经节轴突的延伸和分支；④抑制化学趋向因子所诱导的白细胞运动。有关中枢神经系统损伤后Slit2表达变化的基础研究在脊髓损伤方面相对较早开展。刘兴波等〔8〕观察外伤性脊髓损伤大鼠损伤后1～28 d脊髓前角Slit2表达变化情况，发现1 d内阳性表达即明显升高，3 d达到高峰，5 d开始逐渐呈下降趋势，至28 d接近正常组水平，但仍略高。刘肃等〔9〕制备切割性胸髓损伤大鼠模型，分别通过逆转录聚合酶链反应法和免疫组化法检测Slit2基因表达，观察大鼠损伤后脊髓的Slit2表达情况，逆转录聚合酶链反应法结果显示损伤后12 h即可检测到Slit2 mRNA的表达，逐渐升高于第3天达高峰，之后表达水平逐渐回降。免疫组化检测到Slit2蛋白定位于星型胶质细胞和少突胶质细胞的胞质，在正常大鼠脊髓内表达水平较低，于损伤后第3天出现阳性表达并逐渐增多，第7天达到高峰并趋于稳定，第14天开始逐渐下降。尹明锡等〔10〕用改良Allen打击法制备脊髓损伤大鼠模型，分别用电针及药物早期干预治疗，电针组大鼠于麻醉苏醒后即造模后大约半小时开始刺激“大椎、命门”等督脉穴位，20 min/d，1次/d；药物组大鼠于造模后以30 mg/kg体重剂量的甲泼尼龙经尾静脉注入体内，次日同一时间以5.4 mg/kg剂量的甲泼尼龙经尾静脉重复注射一次，之后不再给药；结果显示，电针组和药物组大鼠脊髓组织中Slit2 mRNA的表达水平均显著升高，与模型组比较均有显著差异，电针组大鼠Slit2 mRNA表达略高于药物组，但两组间无统计学意义。近两年在脑损伤后Slit2表达的基础研究方面也有了一些成果。吕凯等〔11〕观察局灶性脑梗死大鼠大脑皮质区Slit2/Robo1的表达，结果显示脑梗死组Slit2表达水平在术后第1天即开始明显升高，3 d时上升达高峰，14 d回落到接近基础水平；该实验用电针刺激脑梗死大鼠“内关、足三里”等穴，30 min/次，1次/d，电针组Slit2表达水平明显高于模型非干预组，两组在不同时间点表达趋势大体一致，但对照组在14 d时仍高于模型组，提示电针干预可以在一定程度上维持Slit2表达的峰值，延缓下降的趋势；Robo1的表达情况与趋势与Slit2基本一致。崔静等〔12〕用免疫组化法检测宫内感染致脑损伤仔鼠模型组和康复训练组脑皮质及海马区Slit积分光密度，两组Slit表达水平明显高于正常对照组，在14 d时达高峰，之后逐渐呈回落，28 d时已低于第7天，两组间相互比较，康复训练组仔鼠Slit表达水平高于非干预组。田贵华等〔13〕用改良Feeney打击法制备颅脑损伤模型，并针刺脑损伤大鼠“人中、百会”两穴，用免疫组化法观察脑损伤后48 h、6 d损伤局部脑组织Slit2的表达变化，模型组、针刺组大鼠两个时间点Slit2的表达均明显升高，两组比较，针刺组大鼠Slit2表达显著高于模型组。从上述研究成果可以看到，各种中枢神经系统损伤后Slit2表达均有不同程度的升高，而早期干预有助于进一步增强表达水平。近年来，丰富康复训练在脑损伤的康复治疗作用与机制有了较多的研究成果，是丰富环境、运动训练、康复治疗时机等积极因素的有机结合，对脑损伤恢复有着确切的作用，笔者也曾做过一些相关研究，并得到了肯定的观察结果〔14，15〕。本研究说明丰富康复训练对脑出血后脑组织Slit2的表达有确切的增强作用。本实验虽仅从出血侧海马区Slit2表达的角度探讨丰富康复训练对脑出血的治疗意义，但考虑到Slit2对中枢神经系统损伤后神经生长和神经元迁移方面具有的重要导向作用，证实了丰富康复训练在脑出血损伤后中枢神经重构方面的作用及价值，进一步为脑出血的临床早期系统康复治疗的重要性和必要性提供了有力的实验依据并具有一定的指导意义。

1Rosenberg GA，Mun-Bryce BS，Wesley M，etal.Collagenase—induced intracerebral hemorrhage in rats〔J〕.Stroke，1990；21(5)：801-7.

2杨洁，倪厚杰，唐洲平.Ⅶ型胶原酶构建大鼠脑出血模型的组织病理学研究〔J〕.神经损伤与功能重建，2012;7(7)：235-7.

3Stein E，Tessier-Lavigine M.Hierarchial organization of guidance receptor：silencing of netrin attraction by slit through a robo/dcc receptor complex〔J〕.Science，2001;291(5510)：1928-38.

4Marillat V，Cases O，Tuyen K，etal.Spatiotemporal expression patterns of slit and robo genes in the rat brain jour of comparative〔J〕.Neurology，2002;442：130-5.

5Seita H，Ken I，Tetsiji M，etal.Slit and glypican-1 mRNAs are coexpressed in the reactive astrocytes of the injured adult brain〔J〕.Glia,2003;42(2)：130-8.

6Niclou SP，Ehlert EM,Verhaagen J.Chemorepelent axon guidance molecules in spinal cord injury〔J〕.J Neurotrauma，2006;23(3-4)：409-21.

7王枫，都爱莲.Slit：一种新的神经生长导向因子〔J〕.国外医学·神经病学神经外科学分册，2002;29(5)：454-5.

8刘兴波，雷晓婷，刘源，等.大鼠脊髓损伤后神经生长因子BDNF/轴突导向因子Slit的表达变化〔J〕.南京医科大学学报(自然科学版)，2008;28(7)：868-71.

9刘肃，刘华，李化光，等.导向因子Slit2在大鼠脊髓损伤后的表达及其意义〔J〕.中国矫形外科杂志，2007;15(4):293-5.

10尹明锡，宋金铃，时素华，等.电针对大鼠脊髓损伤后Slit2表达的影响〔J〕.陕西中医，2010;31(5)：611-3.

11吕凯，李凤，龚标，等.电针对局灶性脑梗死大鼠皮质Slit2/Robo1表达的影响〔J〕.针刺研究，2013;38(4)：265-70.

12崔静，李哓捷，邓庆先，等.康复训练对脑损伤仔鼠脑组织中slit 表达的影响〔J〕.中国伤残医学，2011;19(5)：20-3.

13田贵华，谭纯，姚海江，等.针刺对大鼠颅脑损伤后轴突导向因子Slit2表达的影响〔J〕.中华中医药杂志，2011;26(5)：1197-200.

14王风波，唐明薇，李晓捷.电针联合丰富康复训练对脑损伤仔鼠脑皮质脑源性神经营养因子表达的影响〔J〕.中国康复理论与实践，2012;18(8)：717-20.

15王风波，李晓捷，唐明薇.丰富康复训练对先天性脑损伤仔鼠脑神经髓鞘发育和修复的影响〔J〕.中国伤残医学杂志，2011;19(9)：6-9.

〔2015-02-04修回〕

(编辑冯超/曹梦园)

四川省卫生厅科研课题(No.120476)

张弘(1977-)，男，副主任医师，讲师，硕士，主要从事传统康复治疗脑损伤研究。

王风波(1979-)，男，主治医师，硕士，主要从事中西医结合治疗脑损伤研究。

R493

A

1005-9202(2016)16-3887-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.008