表没食子儿茶素没食子酸酯对脂多糖诱导胶质细胞炎症的保护作用

陈　华　苗加伟　李　晶　郝　坡

(重庆三峡医药高等专科学校，重庆　404120)



表没食子儿茶素没食子酸酯对脂多糖诱导胶质细胞炎症的保护作用

陈华苗加伟李晶1郝坡

(重庆三峡医药高等专科学校，重庆404120)

目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对细菌脂多糖(LPS) 所致大鼠神经胶质细胞炎症的保护作用。方法取新生乳鼠原代神经胶质细胞培养，利用LPS激活小胶质细胞引起炎症反应。荧光探针检测细胞内超氧化自由基的水平；酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western 印迹检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-8、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、炎性因子蛋白含量的变化。结果LPS激活神经小胶质细胞，促进其释放超氧化自由基，诱导炎症因子的过度表达，大幅上调TNF-α、IL-1β、IL-8炎性因子和升高iNOS蛋白质水平(P<0.05)，EGCG明显抑制超氧化自由基及上述炎症因子的过度产生，减轻LPS对神经胶质细胞的毒性。结论EGCG能减弱LPS引起的体外培养神经胶质细胞的炎症反应。

EGCG；脂多糖；炎症；神经保护

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)具有预防和治疗心脑血管系统疾病、保护神经系统等多种药理作用〔1,2〕。近年研究证实EGCG具有一定抗炎活性〔3～7〕。目前，EGCG对原代培养的脑胶质细胞抗炎作用产生保护尚未见报道。本实验利用细菌脂多糖(LPS)引起大鼠神经胶质细胞急性炎症模型，观察EGCG对神经系统炎症的作用和机制。

1　材料与方法

1.1实验动物出生1～2 d的SD乳鼠，重庆医科大学动物实验中心，实验动物生产许可证号:SYXK(渝) 20022007。

1.2药品及试剂EGCG购自重庆市卓诺生物技术有限公司；血清、LPS、氨基酸对照品及超氧化自由基检测试剂盒购于美国Sigma公司；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自美国R&D公司；所有一抗和二抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3仪器设备二氧化碳注入式电热恒温培养箱(美国Thermo Electron 公司)；超净工作台(苏州精华设备公司)；倒置相差显微镜(日本Nikon公司)；96孔板清洗仪、酶标仪。

1.4方法

1.4.1大鼠原代胶质细胞培养取新生SD小鼠，75%乙醇皮肤消毒5 min后断头，眼科剪开颅取脑，游离两侧大脑皮质置于D-Hank溶液浸润，用镊子剥离脑膜和血管，0.25%胰酶消化制成悬液。悬液过200目钢网后1 500 r/min离心3 min，分离后添加DMEM培养基加灭活后微孔滤膜过滤10%胎牛血清培养液，吸取细胞液接种24孔板，滴加青霉素/链霉素(100 U/L)，调整细胞密度约为1×105/孔。培养皿放入5%CO2恒温培养箱，37℃培养48 h后换液清洗一次，持续培养7～10 d至细胞长满融合备用。

1.4.2分组及加药处理实验分为：①空白对照组；②LPS(10 μg/L)组；③20 μmol/L EGCG；④40 μmol/L EGCG；⑤80 μmol/L EGCG。 每组6孔，实验重复 5 次。空白对照组细胞每孔分别加入等量DMEM基础培养基，其他组胶质细胞培养皿中预先加入EGCG溶液作用24 h，再加入LPS作用2 h。前期细胞培养证实二甲基亚砜(DMSO)浓度<0.05%对胶质细胞无明显毒性反应，药物EGCG采用DMSO溶解，所得混悬液再用DMEM培养液稀释，配置成EGCG标准液。

1.4.3MTT比色法检测细胞活力及胞内超氧化自由基的测定胶质细胞以1×105/孔的密度接种96孔板，加入MTT染色剂噻唑蓝(6 mg/ml)孵育4 h，滴加DMSO，震荡后用全自动酶标仪测定570 nm处OD值并减去空白OD值；此外，用485、530 nm双波长激发，按试剂盒的说明利用二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA) 作为荧光探针检测细胞内超氧化自由基的含量。

1.4.4炎性因子测定经过EGCG处理的细胞，收取细胞培养上清液，根据ELISA试剂盒的说明测定细胞培养液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-8含量变化。裂解液处理加药胶质细胞，15 000 r/min离心20 min，取上清，BCA法蛋白定量，Western印迹测定诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达情况。β-actin作为内参对照，比较不同组细胞蛋白表达差异。

1.5统计学方法采用SPSS17.0 软件进行单因素方差分析。

2　结　果

2.1EGCG细胞对MTT及超氧化自由基的影响与空白对照组比较，在LPS处理的胶质细胞培养模型中，超氧化自由基的产量显著增加(240%)，OD值明显降低(63%)。与LPS组比较，预先用EGCG(20、40、80 μmol/L) 处理的细胞中超氧化自由基的产量明显降低，抑制率分别为26%、33%和37%。EGCG处理组OD值与剂量呈正相关，以空白对照组OD值为参照，分别为68.5%、75.3%和88.9%(均P<0.05)，细胞存活率显著提高。

2.2不同剂量EGCG对胶质细胞炎症因子水平的影响LPS明显刺激TNFα、IL-1β、IL8大量释放；与LPS组比较，不同浓度EGCG均能明显减少上清液中炎症因子的含量，且这一抑制作用与EGCG浓度呈正相关。见表1。

2.3Western 印迹分析结果与空白对照组比较，LPS诱导iNOS蛋白表达明显增加；与LPS组比较，不同浓度的EGCG均能够抑制iNOS的蛋白表达。见图1。

表1　EGCG对细胞培养上清液中炎症因子水平的影响

与空白对照组比较：1)P<0.05，与LPS组比较：2)P<0.05

A.空白对照组；B.LPS组；C.20 μmol/L EGCG组；D.40 μmol/L EGCG组；E.80 μmol/L EGCG组图1　EGCG对细胞内iNOS蛋白表达水平的影响

3　讨　论

神经胶质细胞和神经元的关系密切，神经胶质细胞的炎症反应与神经元凋亡具有很强的相关性。许多神经退行性疾病中都显示出神经胶质细胞的活化以及神经胶质细胞介导的炎症反应导致神经元细胞凋亡和死亡。LPS诱导神经胶质细胞，模拟在人体内发生的上述炎性反应变化，诱发神经元的凋亡，此作用类似于慢性神经系统损伤中引起神经元死亡的过程。本实验应用LPS引起大鼠神经胶质细胞炎症模型，验证了EGCG的抗炎作用。EGCG能明显抑制细菌LPS诱导的炎症因子如TNF-α、IL-8、IL-1β和iNOS的过度表达，从而减轻炎症因子的毒性作用。EGCG通过多靶点机制〔8,9〕对中枢神经系统退行性疾病具有防治作用〔10〕，本实验结果进一步证实它是茶多酚抗炎作用的有效成分之一，这也进一步证实了其他学者对EGCG体外抗炎作用的研究〔11,12〕。

TNF-α是创伤或感染等病理条件下最早产生的功能细胞因子之一，它可刺激IL-6、IL-8、IL-1β等炎症介质，并能协同扩大其生物学效应。增高的IL-1β参与脑水肿的形成，血脑屏障的破坏并进一步诱导其他炎性介质造成神经细胞的毒性，导致细胞肿胀和死亡，EGCG可以减轻损伤增加细胞存活率，这一结果与国外研究一致〔13〕。LPS模拟病理过程下激活一氧化氮合酶(NOS)mRNA表达增加，诱导iNOS水平及活性明显增高，促进一氧化氮(NO)合成，血管内皮通透性增加，炎性加重，而EGCG通过抑制iNOS活化，减轻了炎性损伤程度。

综上所述，EGCG是茶多酚发挥抗炎作用的有效成分之一，具有抑制炎症因子的过度表达，减轻LPS引发脑内炎症反应的作用。本研究结果增加了EGCG对抗炎的认识，拓宽了人们对EGCG用于心脑血管保护药理作用机制的理解〔14,15〕。

1Singh BN,Shankar S,Srivastava RK.Green tea catechin,epigallocatechin-3-gallate(EGCG):mechanisms,perspectives and clinical applications〔J〕.Biochem Pharmacol，2011；82(12):1807-21.

2Singh R,Akhtar N,Haqqi TM.Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate:inflammation and arthritis〔J〕.Life Sci，2010；86(25-26):907-18.

3张惠燕，王剑勇，姚航平.表没食子儿茶素没食子酸酯抑制脂多糖诱导人视网膜内皮细胞中调节活化正常T细胞表达与分泌趋化因子的表达 〔J〕.生理学报,2014；66(2):145-50.

4杜玉,娄红祥.表没食子儿茶素没食子酸酯药理作用研究进展〔J〕.国外医药(植物药册)，2006；21(6):244-9.

5邓凤君，杨迎暴，徐江平，等.表没食子儿茶素没食子酸酯对脊髓损伤大鼠炎症因子释放及神经营养因子表达的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志,2010；16(7):195-8.

6Bae HB,Li M,Kim JP,etal.The effect of epigallocatechin gallate on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in a murine model〔J〕.Inflammation，2010；33(2):82-91.

7Joo SY,Song YA,Park YL,etal.Epigallocatechin-3-gallate inhibits LPS-induced NF-κB and MAPK signaling pathways in bone marrow-derived macrophages〔J〕.Gut Liver,2012；6(2):188-96.

8Chen D,Milacic V,Chen MS,etal.Tea polyphenols,their biological effects and potential molecular targets〔J〕.Histol Histopathol，2008；23(4):487-96.

9Pae M,Wu D.Immunomodulating effects of epigallocate-chin-3-gallate from green tea:mechanisms and applications〔J〕.Food Funct，2013；4(9):1287-303.

10Hǜgel HM,Jackson N.Redox chemistry of green tea polyphenols:therapeutic benefits in neurodegenerative diseases〔J〕.Mini Rev Med Chem,2012；12(5):380-7.

11El-Mowafy AM,Al-Gayyar MM,Salem HA,etal.Novel chemotherapeutic and renal protective effects for the green tea (EGCG):role of oxidative stress and inflammatory-cytokine signaling〔J〕.Phytomedicine,2010;17(14):1067-75.

12张东芳，肖鹏，韩晨露，等.表没食子儿茶素-3-没食子酸酯抑制脂多糖诱导的巨噬细胞促炎因子TNF-α和IL-1β基因表达〔J〕.中国生物化学与分子生物学报,2014；30(4)：402-8.

13Itoh T,Imano M,Nishida S,etal.Epigallocatechin-3-gallate increases the number of neural stem cells around the damaged area after rat traumatic brain injury〔J〕.J Neural Transm,2012,119(8):877-90.

14Andrade JP,Assuncão M.Protective effects of chronic green tea consumption on age-related neurodegeneration〔J〕.Curr Pharm Des,2012；18(1):4-14.

15葛建，林芳，李明揆，等.表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)生物活性研究进展〔J〕.安徽农业大学学报,2011；38(2):156-63.

〔2015-02-16修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

重庆市基础与前沿研究计划项目(cstc2014jcyjA10049)；重庆市高等学校青年骨干教师资助计划(2014年)

郝坡(1980-)，男，硕士，副教授，主要从事生物化学与分子生物学研究。

陈华(1965-)，男，副教授，主要从事生物化学与分子生物学研究。

R285

A

1005-9202(2016)16-3913-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.019

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