杜香多糖的乙醇分级纯化及其性质研究

张乔会，黄晶晶，田盼盼，王建中，罗兴武，*

（1.湖北民族学院科技学院，湖北恩施445000；2.北京林业大学林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京100083）

杜香多糖的乙醇分级纯化及其性质研究

张乔会1，2，黄晶晶1，田盼盼1，王建中2，罗兴武1，*

（1.湖北民族学院科技学院，湖北恩施445000；2.北京林业大学林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京100083）

利用乙醇分级沉淀法提取纯化杜香多糖，采用不同浓度的乙醇（25%、45%、65%、85%和95%）沉淀；采用红外光谱检测多糖组分的基团组成，采用电子扫描显微镜检测多糖组分的外部形态，利用高效阴离子色谱法分析各多糖的单糖组分，并利用热重及X射线衍射分析各组分的物理特征。不同浓度乙醇分级沉淀得到5种多糖组分，各组分在SEM下没有固定形状，红外检测都具有多糖的典型基团，各组分单糖组成差别明显，但都以葡萄糖、半乳糖等为主。a、b、c、d和e 5种多糖的失重率分别是90.1%、72.6%、67.3%、57.4%和55.4%，结晶度分别为10.8%、1.7%、2.1%、3.5%和4.3%。

杜香；多糖；分级沉淀；理化性质

杜香（Ledum palustre L.）为杜香属的常绿灌木［1］，其在大兴安岭70%的区域都有分布［2］。大兴安岭地区干叶年生产量可达536 925 t［3］。杜香枝叶含有粗油、多糖和熊果酸等成分［4-7］。

多糖具有抗氧化［8］、抗肿瘤［9］、调节机体免疫［10］、抗血栓［11］和降血糖［12］等作用，其提取多采用水提醇沉，辅以超声［13］、微波［14-15］、酶法［16］和超高压［17］等方法，而分离纯化主要采用纤维素柱层析［18-19］和透析［20］等方法。目前针对杜香多糖的研究较少，多见进行粗多糖提取［21］的研究。本研究用水提法进行粗多糖提取，利用不同浓度醇溶液析出不同分子量多糖的原理，得到杜香多糖初步分离。另外，采用高效阴离子色谱法简便、高效地分析了各杜香多糖组分的单糖组成，并利用热重及X射线衍射分析了各组分的物理性质，为其进一步研究利用提供了基础参考。随着保健品市场的活跃，杜香资源开发备受关注，而研究杜香多糖各组分及其性质等对于杜香的综合开发利用具有重要意义。

1材料与方法

1.1材料与试剂

杜香采自内蒙古金河，自然风干，磨粉，过40目筛，备用。

无水乙醇、石油醚、蒽酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、氢氧化钠（均为分析纯）：北京化工厂；单糖标准品（鼠李糖，半乳糖，阿拉伯糖，葡萄糖，甘露糖，木糖，半乳糖醛酸，葡萄糖醛酸）（纯度≥99%）：SigmaChem. Co.；98%浓硫酸：北京化工厂；去离子水；超纯水。

1.2仪器

KQ-500E型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；S-3400N型扫描电子显微镜、E-1010型溅射镀膜机：日本日立公司；MILLI-Q Advantage A10型超纯水机：美国密理博公司；RE-5203型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；ICS-3000型双系统离子色谱仪（包括AS50自动进样器）：美国戴安公司；Tensor27型红外光谱仪：德国Bruker公司。

1.3方法

1.3.1杜香多糖的提取方法

采用水提醇沉法。准确称取一定量的杜香枝叶粉末，按质量比1∶20加入去离子水，利用闪式提取器辅助提取4 min，放入恒温水浴震荡箱中震荡2 h，离心分离液体和固体粉末，得到杜香多糖提取液。

1.3.2杜香多糖的分级沉淀方法

根据不同分子量多糖在不同浓度醇中溶解度不同的原理分级纯化杜香多糖，见图1。

图1　杜香多糖的分级沉淀流程图Fig.1Flow-process diagram of fractional precipitation of Ledum polysaccharide

如图1所示，即向得到的多糖混合提取液中加入乙醇，依次调节液体中乙醇浓度分别为25%、45%、65%、85%和95%。每调节一次浓度后，将液体放置于4℃冰箱中静置1 h，然后分离固液两相，固体进行下一步纯化操作，液体则继续加入无水乙醇调节成下一个浓度。

1.3.3杜香多糖的纯化方法

多糖一般可能会与一些蛋白结合形成糖苷、糖蛋白等，也可能含有一定的脂溶性成分，为得到纯度较高的样品，必须对样品进行纯化处理。主要采用有机溶解萃取法进行脱脂肪，即得到的样品加入一定量的石油醚处理一定时间进行萃取，滤去石油醚，将滤渣溶解于一定量的去离子水中，加入酒精至浓度为分级沉淀时液体浓度，放置于4℃冰箱中静置1 h，然后分离固液两相，重复上述操作4次。把前一步得到的固体全部溶解于去离子水中，采用Sevage法进行脱蛋白处理，即按多糖液∶氯仿∶丁醇为16∶4∶1（体积比）加入脱蛋白试剂，在振荡器上振荡30 min，除去固体，液体继续脱蛋白直到无固体析出。除去糖液中的有机溶剂，加入乙醇调节液体浓度为分级沉淀时液体浓度，放置于4℃冰箱中静置1 h，除去液体，把得到的固体冷冻干燥，便可得到杜香多糖样品。

1.3.4杜香多糖的红外分析

取少量样品置于红外光谱仪中进行测定，扫描分辨率2 cm-1，扫描范围为4 000 cm-1～400 cm-1，扫描次数32次。

1.3.5杜香多糖的高效阴离子色谱分析

1.3.5.1杜香粗多糖的水解

称取样品4 mg～6 mg放于玻璃瓶中，加入0.125 mL 72%硫酸溶液和1.35 mL超纯水后放置于105℃烘箱中反应2.5 h，其间每30 min摇晃一次，反应结束后对反应液进行过滤（0.45 μm），取少量过滤液体稀释50倍，备用。

1.3.5.2混合单糖标准液的制备

分别称取一定量的葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖配、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸制成混合单糖标准液备用。

1.3.5.3离子色谱分析

取水解释完成并稀释后的样品及标准品用高效阴离子色谱仪进行检测分析，采用梯度淋洗。检测条件如下：色谱柱：Dionex CarboPacTMPA20分析柱（4 mm× 250 mm），CarboPacTMPA20保护柱（3 mm×30 mm）；检测器：脉冲安培检测器；流速：0.5 mL/min；检测温度：30℃；进样体积：25 μL；淋洗液梯度程序见表1。

表1　淋洗液的梯度程序Table 1Gradient of eluent

1.3.6多糖样品的热重、XRD分析及SEM分析

多糖样品的热重分析、XRD检测及SEM分析参照Pang等方法［22］进行，考察其热稳定性及结晶情况。

1.4数据分析

采用Microsoft Excel及Origin软件整理数据及统计分析。

2结果与分析

2.1杜香多糖的提取及分级纯化

向多糖提取液中加入乙醇并分别调节液体中乙醇浓度为25%、45%、65%、85%和95%。依次分离得到5个多糖组分，记为多糖a、b、c、d和e，5个组分颜色逐渐变浅，多糖a颜色为深灰色，多糖b和多糖c颜色分别为灰色和浅灰色，多糖d的颜色则变为淡黄白色，多糖e接近白色。

2.2杜香多糖组分的红外分析

杜香多糖组分的红外分析图见图2。

图2　5种杜香多糖的红外谱图Fig.2IR spectrum of five kinds of Ledum polysaccharide

从图2可以看出，a、b、c、d和e这5种多糖成分所含基团差异不大，都在3380cm-1、1 800 cm-1～1 600 cm-1、1 450 cm-1、1 109 cm-1～1 040 cm-1和1 040 cm-1等处具有特征吸收峰，说明其含有O-H、C=O、CH2及葡萄糖结构等多糖结构的典型基团。但a和b两种多糖在2 900 cm-1处具有特征吸收峰，说明其可能含有CH3结构。5种多糖都具有多糖的典型基团，说明利用乙醇分级沉淀法分离得到的物质是多糖。

2.3杜香多糖组分的单糖组成分析

5种杜香多糖组分的离子色谱分析图见图3。

根据高效阴离子色谱分析及与单糖混合样品离子色谱图f比对可知，杜香多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，且以葡萄糖、半乳糖及葡萄糖醛酸为主。5个组分具体的单糖组成如表2所示。

当乙醇浓度为45%时，分离得到的多糖组分的单糖组成最为复杂，含有8种单糖，而乙醇浓度较高时分离得到的多糖组分其单糖组成相对简单，只含有半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸等几种单糖。

图3　5种杜香多糖的离子色谱图Fig.3Ion chromatogram of five kinds of Ledum polysaccharide

表2　5种杜香多糖的单糖组成Table 2Monosaccharide component of five kinds of Ledum polysaccharide

2.4杜香多糖组分的热重分析

5种杜香多糖组分的失重结果见图4。

图4　杜香多糖失重图（氮气保护）Fig.4TGA analysis of Ledum polysaccharide（under N2condition）

从图4中失重曲线可以得出，5种杜香多糖组分都经历两次失重过程，一次比较轻微，后一次十分显著，这可能与多糖的吸水性、组成和聚集态等有关。第一次失重出现在100℃以内，失重率为1.50%，这有可能是因为多糖具有吸水性，吸收了一定的空气中的水分，在加热情况下失去水分从而失重明显；第二个失重出现在200℃后，a、b、c、d和e 5种多糖的失重率分别是90.1%、72.6%、67.3%、57.4%和55.4%，试验后坩埚内的粉末颜色依次为灰色、灰色、黑灰相间、黑色和黑色。此温度区间内，5种多糖组分的失重率比重大，说明在该温度范围内，几种多糖组分发生了剧烈的分解反应，反映了杜香多糖在200℃以上时是不稳定的。

2.5杜香多糖组分的X射线衍射分析

杜香多糖组分的X衍射强度曲线图见图5。

图5　5种杜香多糖的X衍射强度曲线图Fig.5XRD intensity curves of five kinds of Ledum polysaccharide

由图5可以看出，杜香多糖的X射线衍射强度曲线最高峰出现的2θ位置大致在15°～25°之间，除a峰形尖利以外，b、c、d和e峰形十分圆顿，基本呈现典型馒头峰的特性。a、b、c、d和e的结晶度分别为10.8%、1.7%、2.1%、3.5%和4.3%。

2.6杜香多糖组分的电镜扫描分析

杜香多糖组分的电镜扫描图见图6。

图6　杜香多糖的扫描电镜图（放大3 000倍）Fig.6ScanningPictureofLedumpolysaccharidebySEM（3000X）

从以上电镜扫描图可以看出，冷冻干燥后的杜香多糖没有固定的形态，由于冷冻干燥的原因，整体结构类似海绵。这也符合多糖没有固定结构的特性。

3结论与讨论

共获得5种不同的多糖组分，各组分在扫描电镜下没有固定形状。红外检测都具有多糖的典型基团，各组分单糖组成差别明显，但都以葡萄糖和半乳糖等为主。a、b、c、d和e 5种多糖的失重率分别是90.1%、72.6%、67.3%、57.4%和55.4%，且其失重率呈递减趋势，用越高浓度乙醇析出的多糖，失重程度越低，这可能是因为用高浓度乙醇析出的杜香多糖具有更复杂的分子结构，或者具有更长的碳链，从而使得其对热等作用具有更强的抵抗能力。a、b、c、d和e 5种多糖的结晶度分别为10.8%、1.7%、2.1%、3.5%和4.3%。除a外，结晶度随着析出液浓度增加而细微增加。这可能是随着析出多糖的乙醇浓度升高，分子量越大的多糖被逐级析出，而分子量越大，分子空间构象越复杂多样，内部也越有可能形成晶形或者相互间越有可能形成稳定晶体，而a则可能是由于没有完全纯化，含有微量的盐等造成其结晶度高于其它组分。

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Ethanol Fractional Purification and Characterization of Polysaccharides from Ledum

ZHANG Qiao-hui1，2，HUANG Jing-jing1，TIAN Pan-pan1，WANG Jian-zhong2，LUO Xing-wu1，*
（1.Science and Technology College of Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，Hubei，China；2.Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

Polysaccharides were extracted from Ledum by the method of water extraction and deposited by various concentrations of ethanol which were 25%，45%，65%，85%and 95%.The morphological characteristics of each polysaccharide component were detected by infrared and electron scanning microscopy.High performance anion chromatography was used for monosaccharide composition analysis.The physical characteristics of each polysaccharide component were known by thermo gravimetric and X ray diffraction analysis.As a result，five different polysaccharide fractions were obtained，and they have no fixed shapes in the SEM and have the typical groups of polysaccharides by infrared analysis.The composition of monosaccharide in each polysaccharide was various，but they were mainly composed of glucose，galactose，and so on.The weight loss rates of a，b，c，d，e polysaccharides were 90.1%，72.6%，67.3%，57.4%and 55.4%，respectively.Each degree of crystallization was separately 10.8%，1.7%，2.1%，3.5%and 4.3%.

Ledum；polysaccharide；fractionalprecipitation；physicochemicalproperty

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.025

2015-11-13

湖北民族学院科技学院科研课题（KJZ201601）；湖北省教育厅科研项目（B2014237）作者简介：张乔会（1986—），男（土家），助教，硕士，研究方向：天然产物提取利用。

罗兴武（1978—），男（土家），副教授，研究方向：食品机械及天然产物提取。