黄芪注射液对胃癌大鼠血清炎症机制、p53、STAT3、VEGF表达的影响

王道军　王　晨　伍　权　丁守勇　方恒忠　徐　弘　张　超　王　斌

(芜湖市第二人民医院，安徽　芜湖　241000)



·基础研究·

黄芪注射液对胃癌大鼠血清炎症机制、p53、STAT3、VEGF表达的影响

王道军王晨伍权1丁守勇2方恒忠2徐弘2张超3王斌3

(芜湖市第二人民医院，安徽芜湖241000)

目的探讨黄芪注射液对胃癌大鼠血清炎症机制、p53、信号转导与激活因子(STAT)3、血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响。方法Wistar大鼠50只随机分为空白组、模型组、黄芪注射液低剂量组(低剂量组)、中剂量组、高剂量组，每组10只。空白组给予大鼠等剂量生理盐水灌胃；模型组于制模成功后给予等剂量生理盐水灌胃；低、中、高剂量组于制模成功后分别给予黄芪注射液0.2、0.4、0.6 ml/100 g体重腹腔注射，1次/d。酶联免疫吸附法测定血清炎症因子水平和免疫组化法测定p53、STAT3、VEGF表达。结果与空白组比较，模型组及各剂量组血清白细胞介素(IL)-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量明显上升(P<0.05)；各剂量组血清IL-6、IL-10、TNF-α含量明显低于模型组，且随剂量增加各因子含量降低越明显(P<0.05)；与空白组比较，模型组及各剂量组p53、STAT3、VEGF阳性表达评分明显增加(P<0.05)；各剂量组p53、STAT3、VEGF阳性表达评分明显低于模型组，且随剂量增加评分越低(P<0.05)。结论黄芪注射液可明显减轻胃癌大鼠炎症反应，降低p53、STAT3、VEGF表达。

黄芪注射液；胃癌；炎症机制；p53；STAT3；VEGF

胃癌病因尚不十分明确，对其治疗以手术为主。手术后化疗成为重要治疗手段，但其效果并不十分理想，化疗药物对机体正常细胞具有一定损伤，致使免疫力下降〔1，2〕。黄芪注射液是常用的一种扶正中药，现代药理研究表明黄芪注射液具有良好的抗肿瘤作用〔3〕。本研究旨在分析黄芪注射液对胃癌大鼠血清炎症机制、p53、信号传导与激活因子3(STAT3)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物和药物实验动物：Wistar大鼠50只，SPF级，雌雄各半，体质量(200±20)g，由北京维通利华公司提供，合格证号：SCXK(京)2007-0001。常规饲养1 w，自由饮食、饮水，维持室温为23℃～25℃，相对湿度70%。实验药物：黄芪注射液(生产厂家：上海福达制药有限公司；批准文号：国药准字Z31020083；规格：每支装5 ml，相当于原药材10 g)。

1.2主要仪器及试剂盒日本OLYMPUS公司生产CX41生物显微镜，美国Bio-Rad公司伯乐对3000型电泳仪。p53抗体购于Santa Cruz公司、STAT3抗体购于Santa Cruz公司、VEGF多克隆抗体购于Santa Cruz公司，白细胞介素(IL)-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3实验分组50只大鼠随机分为空白组、模型组、黄芪注射液低剂量组(低剂量组)、黄芪注射液中剂量组(中剂量组)、黄芪注射液高剂量组(高剂量组)，每组大鼠10只。

1.4胃癌模型制备每组大鼠根据200 mg/kg于腹部给予阿糖胞苷，皮下注射48 h后根据10 Gy吸收剂量进行60Co全身照射，照射后第2天于大鼠内侧近腹股沟处皮下接种胃癌细胞悬液0.8 ml，接种细胞数5×106/只，制成胃癌大鼠模型。造模过程中模型组2只大鼠和低剂量组1只大鼠不明原因死亡。

1.5给药方法空白组给予大鼠等剂量生理盐水灌胃；模型组于模型制备成功后给予等剂量生理盐水灌胃；低剂量组于模型制备成功后给予黄芪注射液0.2 ml/100 g体重，腹腔注射，每日1次；中剂量组于模型制备成功后给予黄芪注射液0.4 ml/100 g体重，腹腔注射，1次/d；高剂量组于模型制备成功后给予黄芪注射液0.6 ml/100 g体重，腹腔注射，1次/d。

1.6酶联免疫吸附法测定血清炎症因子水平于大鼠腹主动脉取血，装于不含抗凝剂的试管内，室温下自然凝集20～30 min，离心，分离血清，置于-80℃保存待测，采用酶联免疫吸附法测定血清炎症因子含量。

1.7免疫组化法测定p53、STAT3、VEGF表达取储存于-80℃下胃癌组织100 mg，组织切片，所有标本切片，厚度5 μm，收至备用的玻片上，将其置于58℃烤箱中烘干熔蜡60 min；脱蜡、水化组织切片，采用3%过氧化氢去离子水孵育6 min，阻断内源性过氧化物酶，再将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液容器中，于95℃持续15 min，取出容器，切片4℃下冷却20 min，再以磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次5 min；滴加1∶100兔抗P53、STAT3、VEGF多克隆抗体，4℃过夜，PBS洗3次，每次5 min；滴加山羊抗兔IgG抗体辣根过氧化物酶(HRP)多聚体，室温条件下放置30 min，PBS冲洗3次，每次2 min；二氨基联苯胺(DAB)显色，将切片加上DAB显色剂，于显微镜下观察染色程度，染色好的切片采用自来水终止显色，用自来水冲洗10 min；在将切片放入苏木精迅速泡一下用自来水冲洗10 min，将切片放入乙酸迅速泡一下用自来水冲洗10 min；切片以75%、85%、95%乙醇分别浸泡脱水1 min，将切片用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ浸泡5 min透明，将切片自然晾干，滴上中性树胶封片，将封好了切片放入烤箱中过夜，在光学显微镜下观察结果。阳性结果：阳性细胞判定以肿瘤细胞胞核内出现棕色颗粒为准，于高倍镜下随机取10个不同视野，各计数100个细胞，结果采用半定量分析。首先对阳性细胞染色强度评分，以无色为0分，以淡黄色为1分，以棕褐色为2分，以棕褐色为3分；再对阳性细胞所占百分比评分，0分为阴性，以阳性细胞≤10%为1分，以阳性细胞占11%～50%为2分，以阳性细胞占51%～75%为3分，以阳性细胞占>75%为4分，结果取二者评分乘积，染色强度与阳性细胞百分比乘积>3分为阳性。

1.8瘤组织处理采用甲醛液对胃癌组织进行充分固定，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片，苏木素-伊红(HE)染色，采用光镜下观察胃癌组织学变化。

1.9统计学方法应用SPSS19.0软件，采用独立样本t检验或双因素方差分析。

2　结　果

2.1各组胃癌组织光学显微镜下观察空白组：大鼠胃黏膜上皮完整，以及细胞形态大小均一，胃窦部和胃体无明显炎细胞浸润；模型组：大鼠胃黏膜大部分萎缩消失，可见肠化生杯状细胞，部分腺体结构不规则；低剂量组：大鼠胃窦部和胃体炎症较模型组轻，且镜下可见上皮坏死细胞脱落，且可出现糜烂；中剂量组和高剂量组胃黏膜上皮相对较完整，细胞形态均一，以及固有膜内腺体排列较整齐。见图1。

2.2各组大鼠血清炎症因子含量比较与空白组比较，模型组及各剂量组血清IL-6、IL-10、TNF-α含量明显上升(P<0.05)；各剂量组血清IL-6、IL-10、TNF-α含量明显低于模型组，且随着剂量增加，含量降低越明显(P<0.05)。

2.3各组大鼠p53、STAT3、VEGF阳性表达评分比较与空白组比较，模型组及各剂量组p53、STAT3、VEGF阳性表达评分明显增加(P<0.05)；各剂量组p53、STAT3、VEGF阳性表达评分明显低于模型组，且随剂量增加评分降低(P<0.05)。见表1。

图1　各组胃癌组织光学显微镜下观察(HE，×200)

组别nIL-6(pg/ml)IL-10(pg/ml)TNF-α(ng/ml)p53蛋白STAT3蛋白VEGF蛋白空白组10204.38±27.4186.23±13.4218.92±2.140.72±0.180.68±0.200.83±0.23模型组8319.82±29.311)249.81±48.311)27.31±2.351)2.85±0.431)2.76±0.671)2.80±0.571)低剂量组9278.48±21.291)2)179.32±34.511)2)25.10±2.091)2)2.21±0.371)2)3)2.08±0.341)2)2.16±0.381)2))中剂量组10251.38±20.911)2)3)143.28±27.161)2)3)23.41±1.871)2)3)1.64±0.291)2)3)4)1.59±0.351)2)3)4)1.69±0.311)2)3)4)高剂量组10225.41±18.491)2)3)4)118.92±24.291)2)3)4)21.08±1.561)2)3)4)1.03±0.231)2)3)4)0.91±0.211)2)3)4)1.14±0.241)2)3)4)

与空白组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与低剂量组比较：3)P<0.05；与中剂量组比较：4)P<0.05

3　讨　论

中医学认为胃癌属“反胃”、“胃脘痛”、“积聚”等范畴，主要是由气血虚弱易发生血瘀、痰凝、气滞，损伤脾肾、耗气伤阴致病〔4,5〕。黄芪注射液可增强患者机体免疫功能，监控与杀伤癌细胞，同时还可提高巨噬细胞活性，调节机体内环境平衡，从而改善宿主的免疫抑制状态〔6，7〕。本研究结果表明，黄芪注射液可通过降低大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α含量，增强其免疫功能。VEGF可诱导血管内皮细胞的有丝分裂，直接刺激血管生成，同时也可诱导血管通透性增加，从而对于血管生长具有重要作用〔8〕。本研究结果表明，黄芪注射液可通过抑制VEGF表达，抑制新生血管形成，从而阻断或逆转胃癌，可能为其治疗胃癌重要机制。p53过表达和基因突变在肿瘤的启动和进展期均起作用，并且发生于癌前病变各个阶段〔9〕。本研究结果表明，黄芪注射液可通过抑制P53表达，发挥抗肿瘤作用。STAT3是一种信号传导与转录激活因子，该因子于多种细胞生长、凋亡、分化中发挥重要作用〔10〕。STAT3蛋白在胃癌组织中高表达，能够作为胃癌诊断和预后的一种分子标志物，且能够为胃癌诊断、治疗提供新的思路〔11〕。本研究说明黄芪注射液可通过抑制STAT3表达，发挥抗肿瘤作用。

1吴异兰,郑国华,庞书勤,等.白藜芦醇预防性给药对胃癌大鼠血清 PG及相关细胞因子水平的影响〔J〕.长江大学学报自然科学版:医学下旬,2014;13(10):3-6.

2刘庆生,蔡丹莉,陈芝芸,等.益气活血方对胃癌前病变大鼠NF-κB、cyclinD1和p16表达的影响〔J〕.中华中医药学刊,2014;34(8):1979-82.

3颜莉芳.黄芪注射液穴位注射治疗中晚期恶性肿瘤的临床观察〔J〕.现代中医药,2014;14(1):48-9.

4刘贝,杨金坤,赵立宇.中医健脾干预治疗对胃癌术后患者生存质量影响分析〔J〕.辽宁中医药大学学报,2015;17(12):73-5.

5田永立,夏宁俊,李烜,等.中西医结合临床路径方案治疗胃癌患者100例临床观察〔J〕.中医杂志,2014;55(22):1921-5.

6尹军平,吕桂泉.胃癌术后早期化疗结合中医辅助治疗的临床观察〔J〕.中华中医药学刊,2013;28(12):2830-2.

7李广涛.艾迪注射液和黄芪注射液治疗晚期胃癌的对比临床观察〔J〕.中国医学工程,2013;21(3):80-1.

8欧玉荣,康敏,周蕾,等.胃癌中幽门螺杆菌L型感染与MIF、MMP9、VEGF表达的关系〔J〕.南方医科大学学报,2014;34(2):180-7.

9王名法,刘友斌.XPF、p53蛋白在胃癌组织中的表达及与幽门螺杆菌L型感染的关系〔J〕.临床与实验病理学杂志,2015;31(10):1089-94.

10蔡根深,王延丽,李美丽,等.复方蜥蜴散不同微粒组合剂对胃癌前病变大鼠Stat3通路Stat3、Bcl-2蛋白表达影响的实验研究〔J〕.时珍国医国药,2014;25(5):1028-32.

11龚代鹏,张竹青,张妍,等.p-STAT3、Survivin和Mcl-1蛋白在胃癌组织中的表达及意义〔J〕.中华临床医师杂志:电子版,2015;9(6):28-32.

〔2015-04-16修回〕

(编辑袁左鸣)

The effect analysis of astragalus injection on the inflammatory mechanisms of gastric cancer in rats serum,and the expression of p53,signal transducer and activator of transcription3 and vascular endothelial growth factor

WANG Dao-Jun,WANG Chen,WU Quan,et al.

The Second People's Hospital of Wuhu,Wuhu 241000,Anhui,China

ObjectiveTo investigate the effect of astragalus injection on the inflammatory mechanisms of gastric cancer in rats serum,and the expressions of p53,signal transducer and activator of transcription3 (STAT3) and vascular endothelial growth factor(VEGF).Methods50 Wistar rats were randomly divided into blank (n=10),model (n=10),astragalus injection of low-dose (LG)(n=10),medial-dose (MG)(n=10) and high-dose (HG) groups (n=10).The inflammatory factors levels were tested by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) and the expressions of p53,STAT3 and VEGF were measured by immunohistochemistry(IHC).ResultsCompared with those of blank group,the serum IL-6,IL-10,TNF-α contents in model group were significantly increased in each dose (P<0.05);the serum IL-6,IL-10,TNF-α contents in each dose were significantly lower than those of model group,and the contents were decreased obviously with the increasing dosage (P<0.05).Compared with those of blank group,the positive expression of p53,STAT3 and VEGF in model group and each dose groups were significantly increased (P<0.05);the positive expressions of p53,STAT3 and VEGF in each dose were significantly lower than those of model group (P<0.05).ConclusionsThe astragalus injection might significantly reduce the inflammatory reaction of gastric cancer in rats and the expressions of p53,STAT3 and VEGF.

Astragalus injection;Gastric cancer;Inflammatory mechanism;p53;STAT3;VEGF

国家自然科学基金(No.81001046);安徽省教委基金资助项目(No.95LJ0072)

王晨(1965-)，男，硕士，主任医师，主要从事急诊与创伤研究。

王道军(1978-)，男，硕士，主治医师，主要从事急诊医学研究。

R392.7

A

1005-9202(2016)18-4405-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.001

1安徽医科大学附属省立医院呼吸科

2安徽医科大学附属省立医院外科

3安徽医科大学第四附属医院肿瘤科