栀子水提物和醇提物对糖尿病小鼠并发抑郁症的防治

王君明　段佩利　师燕然　李　晴　张月月　崔　瑛

(河南中医药大学药学院，河南　郑州　450046)



栀子水提物和醇提物对糖尿病小鼠并发抑郁症的防治

王君明1段佩利师燕然李晴张月月崔瑛1

(河南中医药大学药学院，河南郑州450046)

目的探讨栀子水提物(ZZST)和80%乙醇提取物(醇提物，ZZCT)防治糖尿病并发抑郁症的作用机制。方法雄性昆明小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药MH-FH〔盐酸二甲双胍(MH，100 mg/kg)、盐酸氟西汀(FH，10 mg/kg)联合用药〕、ZZST低、中、高剂量(102、204、408 mg/kg)和ZZCT低、中、高剂量(73、146、292 mg/kg)，连续灌胃(ig)给药21 d，1次/d，末次给药后1 h进行糖水消耗实验(SCT)、开场实验(OFT)、强迫游泳实验(FST)和血糖测试；高效液相色谱法(HPLC)测定栀子提取物中栀子苷含量。结果与正常组比较，模型组小鼠血糖水平显著升高、糖水偏爱显著降低、游泳不动时间显著增加、OFT运动时间和站立次数显著降低；与模型组比较，ZZST(102、204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和MH-FH均可使以上异常指标显著改善，ZZST(204、408 mg/kg)和ZZCT(292 mg/kg)均与MH-FH相比无显著差异；ZZST和ZZCT中栀子苷含量分别为206.8 mg/g和207.1 mg/g。结论栀子提取物ZZST和ZZCT均具有防治糖尿病并发抑郁症作用，且与阳性药MH-FH作用相当；栀子苷可能为栀子防治糖尿病并发抑郁症作用的物质基础之一。

栀子；栀子苷；糖尿病；抑郁症；糖水偏爱；强迫游泳实验；开场实验

糖尿病并发抑郁症是糖尿病常见并发症之一，国外文献报道，糖尿病病人有60%～75%伴有抑郁情绪，其中10%～35%为重度抑郁〔1，2〕。就糖尿病而言，沉重的精神压力、不良情绪不仅会使血糖升高、降低治疗的依从性，还会加速心、肾等并发症的发生，对预后不利。反之，血糖控制不好、病情加重又会导致病人精神痛苦、悲观等，加重抑郁症状。重度抑郁症还会引起悲观和绝望，甚至出现自残和自杀行为。本研究旨在考察栀子提取物防治糖尿病并发抑郁症的作用，并比较其水提物和乙醇提取物作用的差异。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物昆明(KM)小鼠，雄性，SPF级，体质量18～22 g，由河南省实验动物中心提供〔SCXK(豫)2010-0002〕。

1.1.2试药栀子：郑州市张仲景大药房，产地江西，批号150101，经河南中医药大学药学院生药学科陈随清教授鉴定确认为茜草科栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实；栀子苷：上海金穗生物科技有限公司，批号：20130314，纯度>98%；盐酸二甲双胍片：上海信宜药厂有限公司，批号48140908；盐酸氟西汀：常州四药制药有限公司，批号20130701；链脲佐菌素(STZ)：Sigma，批号20150225；蔗糖(分析纯)：津致远化学试剂有限公司，批号2014111061；枸橼酸(分析纯)：天津致远化学试剂有限公司，批号：20150201；氢氧化钠(分析纯)：天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号20140723；生理盐水：河南太龙药业股份有限公司，批号13012152；血糖试纸：江苏鱼跃医疗设备股份有限公司，鱼跃。

1.1.3仪器高效液相色谱仪：美国Waters公司，e2695；UV/visible Detector：美国Waters公司，Waters2489；十万分之一分析天平：上海海康电子仪器厂，AB145S；色谱柱：德国迈克，C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；血糖仪：江苏鱼跃医疗设备股份有限公司，鱼跃710，悦准TMI型；大小鼠开场活动实验系统：成都泰盟软件有限公司，OFT-100；旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司，EYELA，N-1100；TDL-40B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；BS210S型电子天平：北京塞多利斯天平有限公司；XK96-B快速混匀器：姜堰市新康医疗器械有限公司；FW-100高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1栀子提取物制备栀子水提物(ZZST)：采用栀子饮片粗粉，每1 g栀子粗粉加6 ml水(W/V=1∶6)，回流提取2次，每次1 h，4 000 r/min离心10 min，合并离心上清液，回收水至浸膏，60℃减压干燥，称重，4℃保存待用。ZZST得率为20.4%。栀子醇提物(ZZCT)：采用栀子饮片粗粉，每1 g栀子粗粉加6 ml的体积分数为80%的乙醇(W/V=1∶6)，回流提取2次，每次1 h，4 000 r/min离心10 min，合并离心上清液，回收乙醇至浸膏，60℃减压干燥，称重，4℃保存待用。ZZCT得率为14.6%。

1.2.2高效液相色谱法(HPLC)测定栀子提取物中栀子苷含量

1.2.2.1色谱条件Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2489 紫外/可见光检测器，德国迈克Reprosil-Pur Basic C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇：水(35∶65)，检测波长：238 nm；柱温：30℃；流速：1 ml/min；进样量：10 μl。

1.2.2.2对照品溶液制备及标准曲线的绘制精密称取梓醇对照品9.47 mg，加流动相(甲醇∶水=35∶65)制成每1 ml含947 μg的对照品溶液储备液(用0.22 μm有机微孔滤膜过滤，取续滤液作为储备液)，将该贮备液用流动相等比稀释至一系列浓度(7.4、14.8、29.6、59.2、118.4、236.8、473.5 μg/ml)的对照品溶液，储备液及各稀释液按1.2.2.1色谱条件进样，以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标线性回归，绘制标准曲线，记录相关系数r值。

1.2.2.3供试品溶液制备及含量测定分别精密称取ZZST 20.4 mg和ZZCT 14.6 mg，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声20 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，精密量取上清液10 ml，用甲醇定容至25 ml，用0.22 μm有机微孔滤膜过滤，取续滤液，按照1.2.2.1中色谱条件进样，依据标准曲线计算栀子提取物供试品中栀子苷含量。栀子苷含量以mg/g提取物计。

1.2.3动物处理及血糖测试用0.1 mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH 4.2)配制STZ注射液，小鼠在禁食16 h后(不禁水)一次性腹腔注射(ip) STZ (150 mg/kg)造糖尿病模型〔3〕；造模后小鼠经过72 h的自由饮食后，于尾静脉取血，用血糖仪测定血糖值(血糖>11.1 mmol/L为糖尿病模型制作成功)，筛选血糖值>11.1 mmol/L的小鼠再予慢性不可预知温和应激(CUMS)〔4〕，每天随机给予一种应激，CUMS主要包括夹尾3 min(距尾尖1 cm)、禁水24 h(8：00～8：00)、潮湿饲养24 h(将200 ml水加入有锯末的笼底，24 h)、禁食24 h(8：00～8：00)、束缚(5 min)、摇晃(1次/s，15 min)和冷水(8℃)游泳7 min；阳性药(MH-FH)采用盐酸二甲双胍(MH，100 mg/kg)和盐酸氟西汀(FH，10 mg/kg)联合用药(ig给药)，受试ZZST低、中、高剂量(102、204、408 mg/kg，分别相当于栀子原药材临床等效剂量的1、2、4倍剂量)和ZZCT低、中、高剂量(73、146、292 mg/kg，分别相当于栀子原药材临床等效剂量的1、2、4倍剂量)，模型组和正常组仅ig给予等量溶媒(0.5%CMC-Na)，其中正常组不给予造模而模型组造模，两组均不给予受试药物。每天CUMS的同时，给予各受试药物或溶媒，连续21 d，末次给药后1 h进行行为学测试。行为学测试结束后，立即尾静脉取血，测试血糖值。阳性药及各受试药物均用0.5% CMC-Na溶解或混悬至所需给药浓度。

1.2.4糖水消耗试验(SCT)小鼠于实验前24 h训练适应含糖饮水，在禁食禁水12 h后进行SCT。测试时，所有小鼠单笼饲养，在安静的房间进行，每笼即每只小鼠放两个水瓶(内分别装入清水和1%蔗糖水，体积均为100 ml，两水瓶位置随机放置)，2 h后取走水瓶并测量体积(测试前后瓶中水量之差)，测定2 h内小鼠1%蔗糖水摄入体积及清水摄入体积，按公式计算每只动物的糖水偏爱。糖水偏爱=〔糖水摄入体积/(糖水摄入体积+清水摄入体积)×100%〕。

1.2.5开场试验(OFT)采用大小鼠开场活动实验系统OFT-100进行实验。实验时将小鼠放入中心方格内，记录小鼠在5 min内的运动距离和站立次数。

1.2.6强迫游泳实验(FST)〔5〕将小鼠单独放入高20 cm、直径14 cm的圆柱形玻璃缸中，缸内水深10 cm，水温(25±2)℃，从小鼠入水后计时6 min，记录后4 min内游泳累计不动时间(指小鼠在水中停止挣扎，或显示漂浮状态，仅有微小的肢体运动以保持头部浮在水面)。

1.3统计学方法应用SPSS11.5软件，多组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较用LSD法。

2　结　果

2.1栀子提取物中栀子苷含量测定结果实验获得的标准曲线为：y=14 054x-7 597.1，其中x指栀子苷浓度(μg/ml)，y指峰面积，相关系数r=1，线性范围为0.074～4.735 μg；含量测定结果显示，ZZST中栀子苷含量为206.8 mg/g提取物，ZZCT中梓醇含量为207.1 mg/g提取物。

2.2栀子提取物对各组小鼠血糖的影响与正常组比较，模型组小鼠空腹血糖水平显著升高(P<0.01)，表明STZ造糖尿病模型成功。与模型组比较，在给予受试药物3 w后，ZZST(102、204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和阳性药MH-FH均可使高血糖小鼠血糖水平显著降低(P<0.05)，且ZZST和ZZCT与MH-FH相比均无明显差异(P>0.05)。见表1。

2.3栀子提取物对各组小鼠糖水偏爱的影响与正常组比较，模型组小鼠糖水偏爱显著降低(P<0.01)。与模型组比较，在给予受试药物3 w后，ZZST(102、204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和阳性药MH-FH均可使高血糖小鼠糖水偏爱显著升高(P<0.05)，且ZZST和ZZCT与MH-FH相比无明显差异(P>0.05)。见表1。

2.4栀子提取物对各组小鼠强迫游泳不动时间的影响与正常组比较，模型组小鼠FST游泳不动时间显著升高(P<0.01)。与模型组比较，在给予受试药物3 w后，ZZST(102、204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和阳性药MH-FH均可使小鼠FST不动时间显著降低(P<0.05或P<0.01)，且ZZST和ZZCT与MH-FH相比无明显差异(P>0.05)。见表1。

2.5栀子提取物对各组小鼠OFT中运动时间和站立次数的影响与正常组比较，模型组小鼠在OFT运动时间和站立次数均显著降低(均P<0.01)。与模型组比较，在给予受试药物3 w后，ZZST(204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和阳性药MH-FH均可使小鼠OFT运动时间和站立次数显著升高(P<0.05)，且ZZST和ZZCT与MH-FH相比无明显差异(P>0.05)；此外，ZZST低剂量(102 mg/kg)亦可显著升高小鼠OFT的站立次数(P<0.05)。见表2。

表1　栀子提取物对糖尿病并发抑郁症小鼠血糖、糖水偏爱、FST不动时间的影响

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

表2　栀子提取物对糖尿病并发抑郁症小鼠OFT运动时间和站立次数的影响

3　讨　论

糖尿病引发的高血糖使机体器官和组织代谢紊乱，甚至会累及中枢神经系统，诱发精神症状出现。糖尿病患者饮食受限、生活质量下降更易引发抑郁等负面情绪，终而导致糖尿病并发抑郁症。再者，抑郁症患者缺乏运动且饮食不规律，服药依从性差，更加不利于糖尿病的治疗。二者之间的相互影响，加大了糖尿病抑郁症的治疗难度。

栀子具有清心除烦和清三焦郁火之良效，具有降糖解郁理论基础。研究结果已表明，栀子提取物具有降糖〔6〕和抗抑郁作用〔7〕。本研究结果显示，STZ引起了小鼠血糖显著升高，进一步通过CUMS引起了小鼠的抑郁样行为，如糖水偏爱降低(反映抑郁症的核心症状——兴趣缺乏和快感缺失)、游泳不动时间增加(反映抑郁症主要症状——行为绝望)、OFT运动时间(反映水平活动能力)和站立次数(反映垂直活动能力)降低(反映抑郁症主要症状——情绪低落)等，综合提示小鼠糖尿病抑郁症模型复制成功；给予ZZST、ZZCT和阳性药MH-FH 3 w后，过高血糖被显著降低、糖水偏爱显著升高、游泳不动时间显著减少、OFT运动时间和站立次数均显著升高，且ZZST和ZZCT与MH-FH各指标相比均无明显差异，综合提示ZZST和ZZCT均具有防治糖尿病并发抑郁症的作用，且与MH-FH作用相当。

依据栀子苷含量测定结果，如果将栀子提取物的剂量折合至对应栀子苷的剂量，那么ZZST的剂量102、204和408 mg/kg分别相当于栀子苷的剂量为21、42和84 mg/kg；同样，ZZCT的剂量73、146和292 mg/kg分别相当于栀子苷的剂量为15、30和60 mg/kg。依据本实验中ZZST和ZZCT的药理实验结果不难看出，作用强弱与栀子苷绝对量(折合剂量)的多少呈现明显正相关。如糖水偏爱实验结果中，ZZST低、中、高剂量(102、204和408 mg/kg)均明显提高了高血糖小鼠的糖水偏爱且呈现出明显的剂量依赖关系，一定程度上，可以认为随着栀子苷绝对量的增加，对糖水偏爱的升高作用增加；同样的分析结果亦可在本研究的其他几个实验中得到印证。因此，栀子苷可能为栀子防治糖尿病并发抑郁症的重要物质基础之一。

1Perveen S，Otho MS，Siddiqi MN，etal.Association of depression with newly diagnosed type 2 diabetes among adults aged between 25 to 60 years in Karachi，Pakistan〔J〕.Diabetol Metab Syndr，2010；2(1)：17.

2Derakhshanpour F，Vakili MA，Farsinia M，etal.Depression and quality of life in patients with type 2 diabetes〔J〕.Iran Red Crescent Med J，2015；17(5)：e27676.

3杨巍，罗春元，于春雷，等.不同剂量STZ诱导小鼠糖尿病模型的发病机制〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2006；32(3)：432-5，543.

4王亚军，张瑜，田永萍，等.针药结合治疗对慢性应激抑郁模型大鼠行为学的影响〔J〕.中医研究，2008；21(11)：12-5.

5Porsolt RD，Bertin A，Jalfre M.Behavioral despair in mice：a primary screening test for antidepressants〔J〕.Arch Int Pharmacodyn Ther，1977；229(2)：327-36.

6Chen YI，Cheng YW，Tzeng CY，etal.Peroxisome proliferator-activated receptor activating hypoglycemic effect of Gardenia jasminoides Ellis aqueous extract and improvement of insulin sensitivity in steroid induced insulin resistant rats〔J〕.BMC Complement Altern Med，2014；14(1)：30.

7Tao W，Zhang H，Xue W，etal.Optimization of supercritical fluid extraction of oil from the fruit of Gardenia jasminoides and its antidepressant activity〔J〕.Molecules，2014；19(12)：19350-60.

〔2016-01-04修回〕

(编辑袁左鸣)

The effects of extracts from water and ethanol of Gardenia jasminoides Ellis on diabetes complicated with depression

WANG Jun-Ming,DUAN Pei-Li,SHI Yan-Ran,et al.

Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450046,Henan,China

ObjectiveTo investigate the effects of extracts from water and ethanol of Gardenia jasminoides Ellis(GJ) on diabetes complicated with depression.MethodsMale mice were divided into normal,model control,MH-FH as positive control,low,middle and high doses of water extract of GJ (ZZST),and low,middle and high doses of 80% ethanol extract of GJ (ZZCT).Mice were treated with MH-FH,ZZST,ZZCT or solvent 0.5% CMC-Na everyday for 21 continuous days by intragastric administration (ig).Mouse sugar consumption test (SCT),forced swim test (FST),open field test (OFT) and blood glucose test (BGT) were used to observe the preventive effects on diabetes complicated by depression of ZZST and ZZCT,respectively,at 1 h after the last administration.Besides,high performance liquid chromatography (HPLC) was used to measure the contents of geniposide in ZZST and ZZCT.ResultsCompared with those of normal group,blood sugar and immobility time of FST were significantly increased,and sucrose preference,moving time and standing times were all significantly decreased.Compared with those of model group,above abnormal parameters were all significantly ameliorated by ZZST,ZZCT and MH-FH.The contents of geniposide in ZZST and ZZCT were 206.8 and 207.1 mg/g,respectively.ConclusionsZZST and ZZCT exert preventive effects on diabetes complicated with depression equal to MH-FH.Geniposide might be one of the main bioactive compounds of GJ in prevention on diabetes complicated with depression.

Gardenia jasminoides Ellis;Geniposide;Diabetes;Depression;Sucrose preference;Forced swim test;Open field test

国家自然科学基金青年科学基金项目(81503269)；河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目(2014GGJS-072)；郑州市科技攻关计划项目(20150309)；河南中医学院省属高校基本科研业务专项人才培养项目(2014KYYWF-QN01)

王君明(1980-)，男，博士，博士后，副教授，主要从事中药药性药效作用机理及新药研发。

R28

A

1005-9202(2016)18-4410-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.003

1河南中医药大学呼吸病诊疗与新药研发河南省协同创新中心