高胆固醇饮食联合球囊损伤建立兔腹主动脉粥样硬化模型及评价

曹桂秋　李玲玲　刘立志　王贵鹏　徐　洁　骆小梅

(新疆医科大学第五附属医院体检科，新疆 　乌鲁木齐　830011)



高胆固醇饮食联合球囊损伤建立兔腹主动脉粥样硬化模型及评价

曹桂秋李玲玲1刘立志2王贵鹏2徐洁2骆小梅2

(新疆医科大学第五附属医院体检科，新疆 乌鲁木齐830011)

目的探讨高胆固醇饮食联合球囊损伤建立兔腹主动脉粥样硬化模型及评价方式。方法选择雄性新西兰大耳白兔16只，随机分为对照组(n=8)和实验组(n=8)，适应性喂养1 w后，两组均通过手术造成腹主动脉球囊损伤，对照组给予普通饮食(基础饲料)，实验组给予高胆固醇饮食，两组均喂养12 w。分析饲养前后血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平。饲养12 w后，采用血管造影和超声计算药物刺激后收缩率；处死试验模型，并对硬化血管进行病理学检查。结果饲养后，对照组血脂指标与饲养前比较无显著差异(均P>0.05)，实验组饲养后TC、TG、LDL水平较饲养前显著升高，且均高于对照组(均P<0.05)。实验组药物刺激后收缩率均显著高于同组正常部位与对照组损伤部位(均P<0.05)；实验组硬化分级、内膜厚度和内膜增生面积均显著高于对照组，管腔面积显著低于对照组(均P<0.05)。结论胆固醇饮食联合球囊损伤建立兔腹主动脉粥样硬化模型效果良好、稳定，血液生化指标和组织病理改变典型，并可用血管造影和超声的方法确定斑块性质，可靠实用，是研究动脉粥样硬化的良好模型。

胆固醇；球囊损伤；动脉粥样硬化

动脉粥样硬化(AS)是心脑血管疾病的重要病因，粥样硬化斑块会增加动脉管腔狭窄程度，导致组织供血不足，引发心脑血管事件的发生，更严重的是粥样斑块破裂导致的急性血栓栓塞〔1〕。研究表明，斑块破裂导致的血栓形成是导致血管事件的根本原因，其中状态不稳定、具有高危破裂倾向的斑块称之为“易损斑块”〔2〕。研究“易损斑块”必须建立在具有特征性的动物模型上。兔是食草性动物，不易自发形成AS，但其对高脂饮食敏感，是常见的建模动物〔3〕。国内外已有许多研究选择兔作为构建AS的模型，但是各研究在模型的构建方法、病变的描述和评价上存在差异，导致研究间难以交流和比较，研究结果也缺乏良好的兼容性〔4〕。本研究结合已有研究方法，提出高胆固醇饮食联合球囊损伤建立兔腹主动脉AS模型，并从血脂、血管超声和组织病理三个方面评价该模型。

1　材料与方法

1.1动物与方法选择雄性新西兰大耳白兔(清洁级)16只，4月龄，体质量2.2～2.5 kg，由我院动物实验中心提供，所有动物单笼饲养，自由饮水，保持12 h昼夜节律，恒定温度和湿度。随机将动物分为对照组和实验组，各8只。适应性喂养1 w后，两组均通过手术造成腹主动脉球囊损伤，对照组给予普通饮食(基础饲料)，实验组给予高胆固醇饮食，高胆固醇饲料组成：4%胆固醇+10%猪油+86%基础饲料。两组均喂养12 w。

1.2仪器和试剂胆固醇购自Sigma公司，速眠新(2 ml/支，120627，吉林华牧动物保健)，盐酸戊巴比妥那注射液(5 ml：0.1 g/支，121203，上海朝晖药业)，马来酸麦角新碱(1.5 ml/支，130307，扬子江杨业)，普通球囊导管和附件(球囊3.0～3.5 mm×15 mm，Coridis公司)，球囊扩张压力泵(Coridis公司)，4 F桡动脉鞘管和21 G桡动脉穿刺针(Coridis公司)，ATW PTCA引导钢丝(0.014 mm×195 cm，Coridis公司)；全自动生化分析仪(日立7600，日本)，超声诊断仪(GM LOGIQ 400 PRO，美国)，组织脱水机、石蜡包埋系统、切片机(ASP300S、EG1150、RM2235，LEICA，德国)。

1.3球囊损伤术动物术前禁食12 h，3%戊巴比妥钠1 ml/kg耳缘静脉联合速眠新0.05 ml/kg肌注麻醉，动物麻醉成功后表现为呼吸深慢、四肢瘫软、角膜反射迟缓，此时通过耳缘静脉注射肝素钠200 IU/kg，并将兔固定兔台。剪去兔右侧后腿内侧毛发，常规皮肤消毒，在股动脉搏动明显处切口，沿动脉走行方向逐层切开皮肤，钝性分离皮下组织和肌肉，显露股动脉并分离约3～4 cm，结扎远心端。用21 G桡动脉穿刺针进行股动脉穿刺术，借助导丝插入4 F桡动脉鞘管，抽血4 ml进行血生化检验，分析总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。在经皮冠状动脉腔内成型术导丝引导下，逆行送入球囊导管，使球囊位于腹主动脉，选择L3-L4腰椎水平的腹主动脉作为内皮损伤靶点，维持压力0.61～1.01 MPa充盈球囊，并来回拉动增加血管内皮损伤程度，若拉动阻力较小提示球囊直径不够，则替换更大直径球囊，重复操作3次，损伤腹主动脉内膜。推出球囊和导丝，拔出鞘管，压迫止血5 min，并包扎血管，逐层缝合关闭切口，术后连续3 d肌注青霉素80万U/d。

1.4影像学检查喂养12 w后，麻醉后切开上述相同位置皮肤，采用桡动脉穿刺针对右股动脉进行穿刺，导入鞘管，取血4 ml检测血脂指标，在X射线下经鞘管注射4 ml造影剂，在注射前后行正后前位造影，测定球囊损伤部位血管和邻近部位血管直径。动脉内给予麦角新碱，3 min后再次造影，测定药物刺激后血管直径，并计算收缩率=(刺激前血管直径-刺激后血管直径)/刺激前血管直径。

1.5病理检查检测完收缩率后，过量麻醉处死，解剖动物，截取腹主动脉约2 cm，生理盐水冲洗干净后保存于4%多聚甲醛中，石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色后光镜下观察。依据美国心脏病协会血管病变委员会推荐的《AS分级标准》〔5〕对实验动物组织切片进行观察分级：0级，内膜光滑，无奶油样病变；1级，内膜有奶油样病变，但未见突出表面的斑块；2级，有斑块突出，面积<3 mm2；3级，有散在斑块，面积>3 mm2；4级，斑块融合成片，且面积>3 mm2；5级，斑块几乎覆盖整个动脉内膜。通过图像分析软件计算管腔面积、内膜厚度、增生内膜面积。

1.6统计学方法应用SPSS17.0软件，计量资料组间比较采用t检验，计数资料组间比较用χ2检验。

2　结　果

2.1两组动物饲养前后血脂水平比较饲养前，两组动物血脂各指标均无显著性差异(均P>0.05)；12 w后，对照组血脂指标仍未见显著差异(均P>0.05)，实验组TC、TG、LDL水平较饲养前显著升高，且均高于对照组(均P<0.05)，HDL在饲养前后略有升高，但未见统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.2两组动物药物刺激后血管收缩率比较主动脉造影后，给予药物刺激，结果显示，实验组球囊损伤部位收缩率为(0.48±0.18)%，与同组正常部位〔(0.08±0.02)%〕比较有统计学差异(P<0.05)，与对照组损伤部位〔(0.08±0.03)%〕比较也有统计学差异(P<0.05)。对照组邻近正常部位血管收缩率为(0.07±0.02)%。

2.3两组动物病理检查结果比较直视下可见对照组血管柔软有弹性，颜色均匀呈粉色，管腔内光滑；实验组血管僵硬，黄白相间，内壁增厚凸起。HE染色后可见对照组内皮细胞完整，中层肌细胞排列整齐，形态正常，胞质呈酸性红染，可见少量脂质沉积；实验组内皮脱落，可见粥样斑块，在斑块中可见新生血管和炎细胞浸润，内膜下可见泡沫细胞，平滑肌排列紊乱并增生，胞质嗜酸性减少。实验组硬化分级、管腔面积、内膜厚度和内膜增生面积与对照组有显著差异(P<0.05)。见表2。

表1　两组动物饲养前后血脂水平比较

与对照组比较：1)P<0.05；与饲养前比较：2)P<0.05

表2　两组动物病理检查结果比较±s,n=8)

3　讨　论

实验动物模型是研究相应疾病的基础，目前较常用的造模动物为小鼠和兔，但是小鼠血浆胆固醇水平较低，且存在于HDL颗粒中，很难诱导AS；载脂蛋白缺陷和(或)LDL受体缺乏的小鼠虽然易形成AS，但是价格高昂〔6〕。其他动物如猴、猪、狗，同样受限于费用和体型，不宜大样本造模和研究〔7〕。理想的动物模型应当具备如下特征：①具有与人类相似的疾病特征和发生发展过程；②动物与人类具有共同的致病因素；③造模方法简单易行，成功率高；④模型稳定，疾病特征明显，可重复性高；⑤造模成本低〔8〕。

研究表明，高脂饮食可引起兔血脂水平升高，会同时作用于兔全身血管，但是不同部位血管及不同节段的血管的病变并不是同步发生的，胸主动脉发展最快程度最深，其次为主动脉根部，再次是腹主动脉〔9〕。然而饮食造模的周期比较长，且进展缓慢。本研究在传统饮食法的基础上调整胆固醇摄入量为5%，同时联合应用球囊损伤法，造成腹主动脉内膜的损伤，可增加造模成功率并缩短造模时间，避免长期高脂饮食导致的其他疾病对研究的干扰〔10〕。研究结果证实，高胆固醇饮食显著造成了兔高胆固醇血症，与以往研究一致〔11〕，LDL的长期高水平可损伤血管内皮，增加造模成功率。

动物AS模型的评价，目前主要依据病理检查，但此法必须处死动物，不利于进一步研究斑块的发生发展和药物干预〔12〕。本研究结合血管造影和血管内超声，不仅能观察到斑块，还可以检测斑块性质。结果显示，实验组球囊损伤部位血管收缩率显著高于正常血管，提示该法评价斑块易损性具有较高的判断价值。此外，病理学检查显示结果与现阶段所掌握的动脉粥样硬化病变的特点一致〔13〕，提示该造模方法显著有效。

综上所述，胆固醇饮食联合球囊损伤建立兔腹主动脉AS模型造模效果良好、稳定，血液生化指标和组织病理改变典型，并可用血管造影和超声的方法确定斑块性质，可靠实用，是研究AS的良好模型。

1张璞璞,袁吉祥,姚成立,等.高同型半胱氨酸血症及其所致动脉粥样硬化动物模型的复制〔J〕.中国组织工程研究,2012;16(7):1233-6.

2杨俊,岳增辉,谢涛,等.高脂饲养结合腹主动脉球囊损伤制作兔腹主动脉粥样硬化模型的研究〔J〕.中国中医急症,2014;23(5):792-3,796.

3刘洋,何春水.兔动脉粥样硬化改良模型的建立及其评价〔J〕.泸州医学院学报,2015;38(4):408-12.

4陆红玲,汤阳,黄跃,等.颈动脉球囊损伤对高同型半胱氨酸诱导兔动脉粥样硬化病变的形成无明显影响〔J〕.中国比较医学杂志,2014；24(4):43-6.

5胡岗珠,岳增辉,杨俊,等.家兔动脉粥样硬化球囊损伤模型的制备过程与分析〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志,2014;12(5):593-4.

6高雪,郑晓慧,宋宏萍,等.超声造影技术评价兔腹主动脉斑块内新生血管形成及斑块稳定性的研究〔J〕.现代生物医学进展,2012;12(16):3080-3.

7谢显学,谭学瑞.兔动脉粥样硬化模型研究现状〔J〕.中国医药,2013；8(2):272-4.

8黄昊,杜悠雯,谢瑞强,等.基于人类信号网络和表达谱数据挖掘动脉粥样硬化相关模块〔J〕.现代生物医学进展,2015;15(2):336-42.

9刘新叶,杨东伟,程勇,等.兔颈总动脉破裂粥样硬化斑块模型的建立〔J〕.中国当代医药,2014;21(9):19-23.

10马娜,任俊红,韩秀婕,等.超声造影评价兔腹主动脉粥样硬化的价值〔J〕.中华老年医学杂志,2013;32(2):208-11.

11李超伦,王文平,陈伶俐,等.超声造影定量分析评价兔粥样斑块内新生血管与病理的对照研究〔J〕.中华超声影像学杂志,2012;21(8):711-4.

12Zhang G,Chen Y,Bilal-Waqar A,etal.Quantitative analysis of rabbit coronary atherosclerosis.Practical techniques utilizing open-source software〔J〕.Anal Quant Cytopathol Histpathol,2015;37(2):115-22.

13Li C,Tu Y,Liu TR,etal.Rosiglitazone attenuates atherosclerosis and increases high-density lipoprotein function in atherosclerotic rabbits〔J〕.Int J Mol Med,2015;35(3):715-23.

〔2015-11-19修回〕

(编辑袁左鸣)

新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(No.2014211C124)

曹桂秋(1972-)，女，博士，主任医师，主要从事心血管疾病、老年疾病诊疗及营养保健方面的研究。

R541.4

A

1005-9202(2016)18-4426-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.010

1新疆医科大学第五附属医院超声科

2新疆医科大学第五附属医院心内科