转化生长因子-β1/Smad3信号通路在肾间质纤维化大鼠肾脏组织中的表达和作用

黄继义　钟鸿斌　彭永挑　朱戉述

(厦门市第五医院肾内科，福建　厦门　361000)



转化生长因子-β1/Smad3信号通路在肾间质纤维化大鼠肾脏组织中的表达和作用

黄继义钟鸿斌彭永挑朱戉述

(厦门市第五医院肾内科，福建厦门361000)

目的探讨转化生长因子(TGF)-β1/Smad3信号通路在肾间质纤维化(RIF)大鼠肾脏组织中的表达和作用。方法80只SD雄性大鼠编号，随机平均分为单侧输尿管结扎(UUO)模型组和假手术组，UUO模型组行大鼠左侧输尿管结扎术，假手术组游离左侧输尿管但不予结扎，术后第3、7、10、14、21天时每组分别处死8只，留取大鼠左侧肾脏用于病理以及蛋白测定,HE、Masson染色光镜观察肾脏组织形态学的改变，应用蛋白质印迹法(Western印迹)和免疫组化法(SP)检测TGF-β1、Smad3蛋白表达，PCR检测TGF-β1、Smad3 mRNA的表达。结果电镜观察结果显示RIF大鼠建模成功，随着结扎时间延长，UUO模型组RIF指数、Smad3与TGF-β1蛋白及mRNA表达均逐渐升高(P<0.05)，同一时间UUO模型组各指标均高于假手术组(P<0.05)。Smad3、TGF-β1与RIF指数呈正相关(r=0.564，0.735，P<0.05)，TGF-β1与Smad3间呈正相关(r=0.673，P<0.05)。结论通过检测肾脏组织中Smad3、TGF-β1的表达可判断RIF病情，对疾病的早期发现有重要意义。

肾间质纤维化；转化生长因子-β1/Smad3信号通路

肾间质纤维化(RIF)是慢性肾脏疾病的共同特征，以小管基底膜成分、间质细胞外基质发生定性和定量改变、肾小管萎缩和肌纤维母细胞积聚为特征〔1〕；肾小管上皮细胞-间充质细胞转化是RIF的重要发病机制之一〔2〕。转化生长因子(TGF)-β1是一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族，是目前发现最强的促肾纤维化信号转导因子，可通过Smad蛋白表达实现传导〔3〕。本文研究TGF-β1/Smad3信号通路在肾脏组织中的表达和作用。

1　资料与方法

1.1实验动物购自厦门大学医学院动物中心健康SD雄性大鼠80只(4～5周龄)，体重150～200 g，室温喂养、正常饮水，饲养3 d，备用。

1.2实验仪器和试剂石蜡切片机(德国SLEE)、PCR仪(DTC-3G型，西安天隆科技有限公司)，台式低温高速离心机(TGL20M-湖南湘立科学仪器有限公司)，酶标仪(Thermo热电 Scienti)、NanoQuant PlateTM微量检测板。-80℃冰箱、光学显微镜以及常见微量移液枪、枪头等。

RIRA蛋白裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒、蛋白上清缓冲液及DAB显色试剂盒均购自南京建成生物工程研究所、Smad3一抗(小鼠抗大鼠)和二抗(兔抗大鼠)均购自圣克鲁斯生物技术公司、β-actin多克隆抗体购自南京生兴生物技术有限公司，TGF-β1多抗购自Santa Cruz Biotech、SP免疫组化试剂盒(通用)购自北京北瑞达医药科技有限公司、磷酸盐缓冲液(PBS)、总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3动物分组和建模80只SD雄性大鼠进行编号，按照随机数字表法将其分为单侧输尿管结扎(UUO)模型组和假手术组，各40只。UUO模型组行大鼠左侧输尿管结扎术，假手术组游离左侧输尿管但不予结扎，其余手术步骤与模型组相同。

建模具体步骤：按照35 mg/kg剂量将大鼠用1%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉，将大鼠仰卧四肢固定鼠板上，常规手术部位备皮和消毒，取大鼠左肋下0.5 cm为切口，依次切开皮肤、肌肉、组织直到腹膜，游离输尿管，大约在输尿管中部夹闭结扎，完成后逐层缝合，关闭切口。术后两组大鼠常规喂养，分别于术后第3、7、10、14、21天时每组各处死8只，留取大鼠左侧肾脏用于病理以及蛋白测定，根据电镜观察病理纤维化程度(RIF指数)判断建模成功与否，RIF指数>14为建模成功。

1.4肾脏组织形态学的改变取适量肾组织，常规石蜡包埋，甲醛固定，脱水，制厚切片4 μm，行HE、Masson染色，光镜下观察肾脏病理改变，×400倍下观察每张切片，选择5个不同的视野，将染色呈绿色的区域定位为纤维化阳性区域，以阳性面积/整个视野面积比值(RIF指数，取平均值作为每张切片的RIF指数)作为评价肾组织纤维化程度指标，同时观察肾小管解离、“无肾小管的肾小球”等特征。

1.5肾组织Smad3与TGF-β1蛋白和mRNA表达肾组织Smad3蛋白：采用蛋白质印迹法(Western印迹)检测肾组织蛋白质表达水平，取30 mg肾组织(液氮保存)，加入适量RIPA裂解液，严格按照说明书进行，应用BCA蛋白检测试剂盒定量检测蛋白总浓度，测定总蛋白浓度是否符合要求，样品加入蛋白上样缓冲液，取30 μg等量蛋白上样，同时取2.5 μl Marker标志物上样，进行SDS-PAGE电泳，电泳2 h，正常转膜，脱脂奶粉封闭1 h，TBST缓冲液清洗4次，加入Smad3一抗，冰上过夜，继续TBST缓冲液清洗4次，加入Smad3二抗，常温孵育1h洗涤，暗箱中检测电泳条带灰度值，计算蛋白表达水平。

肾组织TGF-β1蛋白：采用免疫组化法检测TGF-β1蛋白表达，将石蜡切片脱蜡，置于3%H2O2中室温孵育5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，滴加PBS代替一抗，37℃孵育1～2 h，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10～30 min，PBS冲洗，滴加适量辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10～30 min，DAB显色，自来水充分冲洗，复染，脱水，封片。采用高倍镜观察切片，以棕色为阳性。肾组织Smad3和TGF-β1 mRNA：取30 mg肾脏组织，严格按照总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒要求步骤进行操作，提取的总RNA吸取2 μl于NanoQuant PlateTM微量检测板上，于酶标仪波长260 nm和280 nm处检测吸光度值(OD)，OD260/OD280在1.8～2.0为合格。引物设计(β-actin为内参)：基因β-actin，GenBank:EF095208.1，长度214 bp，引物序列正义5'GGTGGGAATGGGTCAGAAGG3'，反义5'GTTGGCCTTAGGGTTCAGGG3'；基因Smad3，GenBank:AF016189.1，长度548 bp，引物序列：正义5'AAGGCGACACATTGGGAGAG3'，反义5'ACAGGCTGGTGCCTTAGTTG3'，基因TGF-β1，GenBank:NM_011577.1，长度344 bp，引物序列正义5'GCTGAACCAAGGAGACGGAA3'，反义5'AGAAGTTGGCATGGTAGCCC3'。PCR扩增按照两步法，95℃预变性3 min，95℃变性20 s，65℃退火20 s，72℃延伸30 s，35个循环。

1.6统计学方法应用SPSS13.0软件，计量资料符合正态分布方差齐性的行组间t检验，不同天数比较采用重复测量方差分析，采用Pearson相关或者Spearman秩相关。

2　结　果

2.1肾脏组织形态学改变电镜下观察，术后1 w肾脏上皮细胞出现了空泡，有轻微间质水肿，术后21 d出现弥漫性炎症细胞浸润，各观察时间点的RIF指数>14，说明建模均取得成功。随着结扎时间延长，UUO模型组RIF指数逐渐升高(P<0.05)，假手术组各时间点无统计学差异(P>0.05)；同一时间UUO模型组RIF指数均高于假手术组(P<0.05)。见表1。

2.2肾组织Smad3与TGF-β1蛋白表达 随着结扎时间延长，UUO模型组Smad3与TGF-β1蛋白表达逐渐升高(P<0.05)，假手术组无统计学差异(P>0.05)；同一时间UUO模型组蛋白表达水平均高于假手术组(P<0.05)。见表2。

2.3肾组织Smad3与TGF-β1 mRNA表达随着结扎时间延长，UUO模型组Smad3与TGF-β1 mRNA表达逐渐升高(P<0.05)，假手术组各时间点差异无统计学意义(P>0.05)；同一时间UUO模型组Smad3、TGF-β1 mRNA表达率均高于假手术组(P<0.05)。见表3。

2.4Smad3、TGF-β1与RIF指数相关性分析UUO模型组Smad3、TGF-β1与RIF指数呈正相关(r=0.564，0.735；P<0.05)，TGF-β1与Smad3呈正相关(r=0.673，P<0.05)。

表1　两组不同时间RIF指数

表2　两组不同时间肾组织Smad3及TGF-β1蛋白表达比较

表3　两组不同时间肾组织Smad3、TGF-β1 mRNA表达比较

3　讨　论

RIF的发病机制是正常肾间质和肾小管结构被大量聚集的细胞外基质所代替而造成，如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、层黏连蛋白等，细胞外基质(ECM)由成纤维细胞、肾小管上皮细胞和血管内皮细胞等细胞合成和分泌,其中成纤维细胞是沉积ECM的主要来源，在RIF中发挥着重要作用。RIF可导致肾功能损害，其治疗方法主要是抑制纤维细胞活性及ECM合成，刺激ECM降解〔4〕。肾小管上皮细胞转分化与肾脏纤维化的关系密切〔5〕，但从肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤介导细胞死亡方面探讨肾小管解离参与RIF进展机制研究较少。

Smads家族蛋白在将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，不同Smad介导不同TGF-β家族成员的信号转导〔6～8〕。TGF-β作为配体形成的受体复合物〔9〕，通过激活Smads进入核内，共同激活或抑制靶基因的转录〔7〕，本研究结果说明随着结扎时间的延长，肾脏纤维化程度逐渐加重。此外，本研究还发现，随着梗阻时间延长，TGF-β1与Smad3表达异常，推测TGF-β1与Smad3的高表达与RIF的发生、发展有关。TGF-β1与Smad3间存在协同作用，说明TGF-β1/Smad3信号通路在RIF的发生发展过程中起重要作用，这与任韫卓等〔10〕的研究结果类似。

1苏丽娜,覃远汉,周添标,等.转化生长因子-β1/Smad3信号通路在肾间质纤维化大鼠肾脏组织中的表达和作用〔J〕.实用儿科临床杂志,2011;26(5):325-8.

2崔晓影.乌司他丁对大鼠肾间质纤维化中TGF-β/Smads信号转导通路的干预作用〔D〕.哈尔滨：哈尔滨医科大学,2011.

3雷强.田七注射液对阿霉素肾纤维化大鼠的CTGF/TGF-β1/Smads信号通路的影响〔D〕.桂林：广西中医药大学,2012.

4刘俊英.Smad2/3在大鼠肾间质纤维化中的表达及促红细胞生成素的保护作用〔D〕.哈尔滨：哈尔滨医科大学,2010.

5李素仙.活性维生素D3对UUO大鼠肾间质TGF-β1/Smads信号轴核酸表达的影响〔D〕.太原：山西医科大学,2013.

6王文文.温莪术对肾间质纤维化大鼠肾脏TGF-β1/Smad信号通路及结缔组织生长因子的影响〔D〕.上海：上海中医药大学,2013.

5Wang Y,Lin C,Ren Q,etal.Astragaloside effect on TGF-β1,SMAD2/3,and SMA expression in the kidney tissues of diabetic KKAy mice〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2015;8(6):6828-34.

6Wang Y,Wang B,Du F,etal.Epigallocatechin-3-gallate attenuates unilateral ureteral obstruction-induced renal interstitialfibrosis inmice〔J〕.J Histochem Cytochem,2015;63(4):270-9.

7Hamzeh MT,Sridhara R,Alexander LD.Cyclic stretch-induced TGF-β1 and fibronectin expression is mediated by β1-integrin through c-Src-and STAT3-dependent pathways in renal epithelial cells〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2015;308(5):F425-36.

8Samarakoon R,Helo S,Dobberfuhl AD,etal.Loss of tumour suppressor PTEN expression in renal injury initiates SMAD3-and p53-dependent fibrotic responses〔J〕.J Pathol,2015;236(4):421-32.

9Overstreet JM,Samarakoon R,Cardona-Grau D,etal.Tumor suppressor ataxia telangiectasia mutated functions downstream of TGF-β1 in orchestrating profibrotic responses〔J〕.FASEB J,2015;29(4):1258-68.

10任韫卓,郝军,史永红,等.TGF-β1激活smad信号通路影响人肾小管上皮细胞增殖与凋亡〔J〕.重庆医学,2007;36(20):2079-2081,封2,插1.

〔2015-10-23修回〕

(编辑郭菁)

厦门市科技局科技计划惠民项目(No.3502Z20144068)

黄继义(1963-)，男，主任医师，主要从事肾内科疾病研究。

R693.4

A

1005-9202(2016)18-4433-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.013