11β-羟基类固醇脱氢酶1型、促酰化蛋白在肥胖大鼠伴高脂血症形成中的机制

吴国琼　林　梅　张　雨　郭菲菲　候亚莉　邱　璇　邓春地　杨艳群　袁惠萍

(武汉市普爱医院(西院)内分泌科，湖北　武汉　430034)



11β-羟基类固醇脱氢酶1型、促酰化蛋白在肥胖大鼠伴高脂血症形成中的机制

吴国琼林梅张雨郭菲菲候亚莉邱璇邓春地杨艳群袁惠萍

(武汉市普爱医院(西院)内分泌科，湖北武汉430034)

目的11β-羟基类固醇脱氢酶1型(11β-HSD1)、促酰化蛋白(ASP)在肥胖伴高脂血症中的机制。方法随机选取SD雄性大鼠60只，均分为实验组和对照组，实验组施以高脂饮食，对照组常规饮食，观察1～8 w进食量、体重和血压的变化；并在8 w后检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平。处死动物取其肝脏，利用RT-PCR方法测量组织中11β-HSD1、脂蛋白酯酶(LPL)mRNA的变化，利用转染技术转染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪细胞并与不同浓度ASP培养，以正常脂肪细胞作为对照，观察细胞凋亡和细胞活性。结果实验组食量先下降后上升，而对照组逐渐下降；实验组体重急剧上升，且大于对照组；实验组血压逐渐上升，而对照组维持一定水平；在第8周，实验组血脂水平显著高于对照组；实验组11β-HSD1 mRNA水平大于对照组，而LPL mRNA水平则相反；随着ASP溶液浓度的升高，未转染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪细胞活力逐渐上升。而转染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪细胞活力不变，而细胞凋亡与此相反。结论11β-HSD1是导致高脂血症和肥胖的一个有效因素，ASP通过11β-HSD1基因片段对脂肪细胞进行调节，从而影响脂类代谢。

11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型；促酰化蛋白；肥胖；高脂血症

肥胖症是一种多因素导致的慢性代谢性疾病〔1〕，肥胖人群中高脂血症的发病率达50%以上〔2〕，由此导致冠心病、高血压、动脉硬化性血管病、2型糖尿病的发生和病死率也显著增高。肥胖症的脂代谢异常发生机制有很多，11β-羟基类固醇脱氢酶1型(11β-HSD1)、促酰化蛋白(ASP)参与高脂血症的形成，但两者在肥胖患者脂代谢中的关系尚不清楚。本文研究11β-HSD1及ASP在肥胖伴高脂血症形成过程中的相互联系。

1　材料与方法

1.1材料60只清洁级SD雄性大鼠，体重150～200 g，常规动物实验室饲养，随机分为对照组及实验组，每组30只。人类成骨细胞3T3-L1前脂肪细胞在1∶1混合Ham′s F12的基质和Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)培养液中培养，培养液中添加2.5 mmol/L左旋谷酰胺和 0.3 mg/ml G418 (Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)，并且添加10%小牛血清 hFOB 1.19 细胞在5% CO2，37℃温箱中培养。

1.2方法

1.2.1造模并检测静脉血中脂蛋白酯酶(LPL)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平对照组给予常规普通基础饲料，食量不低于15 g，水量不低于30 ml；实验组除了基础饲料外，还给予高脂高营养饲料(100 g基础饲料中加入全脂奶15 g 、猪油5 g、鸡蛋黄50 g、黄豆15 g、鱼肝油10滴)喂养6～8 w，通过检测大鼠体重并参考2010年国际糖尿病联盟制订的代谢综合征全球共识要求，满足TG、LDL，高血压和空腹血糖(FPG)升高，确定是否造模成功。用ELISA法检测血浆ASP(北京方程生物科技有限公司，北京)水平，自动生化分析(iChem-340全自动生化分析仪，库倍儿，深圳)测定血浆TG、TC、LDL、VLDL、HDL水平。

1.2.2RT-PCR方法检测各组织11β-HSD1和LPL mRNA水平造模成功后处死大鼠，并去全部大鼠的肝脏、脂肪和肌肉，液氮速冻后放入研钵，研碎，按照常规组织提取RNA的方法离心，并加入氯仿、异丙醇，反复离心，最后去白色凝胶样沉淀，去除上清液后用DEPC-水溶液溶解，取10 μl，加入1 μl Oligo dT，水浴后再冰浴，全部参照试剂说明书操作。1β-HSD1引物：上游：5′-GCAGAGCGATTTGTTGTT-3′，下游：5′-TGTCATATGAAGCCGAGGA-3′；LPL的上游引物5′-GGACGGTGACAGFAATGTATG-3′，下游引物5′-CAGCACGATCCAGACCACTAA-3′，各引物链均由上海生工合成。按照PCR的反应条件和流程进行30个循环，用免疫荧光法定量检测mRNA浓度。

1.2.311β-HSD1 siRNA设计技术通过GenBank查询得到11β-HSD1的cDNA序列，利用WIsiRNA Selection Program提供的设计软件，设计以11β-HSD1基因为靶标的siRNA，其中实验组选用两个独立的、针对该靶基因的siRNA，设计结果为6条64 nt的寡聚核苷酸单链，每两条互补，送生物技术公司合成。

1.2.4重组腺病毒11β-HSD1 siRNA载体构建技术特异性针对11β-HSD1基因的寡聚核苷酸单链在Tris盐/EDTA缓冲系统(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L Nacl，pH8.0)中退火为双链，在连接到BglⅡ/HindⅢ双酶切线性化pSUPER载体上，对阳性克隆进行酶切和测序鉴定，再用EcoRⅠ/HindⅢ双酶切含siRNA表达盒子的pSUPER载体，并将其连接到同样双酶切的穿梭载体EH006上，然后和腺病毒辅助质粒Pjm17 共转染HEK293进行同源重组，构建重组腺病毒11β-HSD1 RNAi表达载体。PCR鉴定，并利用终末稀释法测定腺病毒滴度。

1.2.5细胞转染技术将FuGENE HD转染剂、重组质粒和无菌水放置室温下，在六孔板中配置转染液，每孔中吸入100 μl无菌水、2 μg重组质粒和6 μl FuGENE HD，混匀。室温放置15 min，待六孔板中细胞80%～90%3T3-L1脂肪细胞融合时，加入上转染液100 μl，慢速混匀30 s，培养72 h分析结果。

1.2.6Western印迹检测11β-HSD1蛋白表达严格按照说明书检测转染后3T3-L1脂肪细胞的11β-HSD1蛋白表达情况。

1.2.7MTT检测细胞活性将3T3-L1脂肪细胞分别放在含有0、50、100和200 mg/L ASP溶液中培养24 h,同时设空白对照组。加入20 μl终浓度为5 mg/ml的MTT，将细胞置于37℃培养4 h。之后小心移除上清，每孔加入100 μl二甲基亚砜，放置于摇床上震荡10 min，充分溶解结晶，用移液器反复吹吸使晶体溶解。培养板放于37℃培养，溶解气泡后，用全自动定量绘图酶标仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)在570 nm波长下测定，计算公式为实验孔A570/对照孔A570×100%。

1.2.8细胞凋亡检测用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)分析细胞凋亡的百分率。将转染3T3-L1的脂肪细胞放在含有0、50、100和200 mg/L ASP的溶液中培养24 h，处理后细胞在2 000 r/min离心5 min，然后用PBS洗涤2次，吸取250 μl的2×结合缓冲液和250 μl去离子水，混匀，然后将细胞悬浮于400 μl×结合缓冲液中，使浓度为1×105cells/ml，再加入5 μl Annexin V-FITC和碘化丙啶，上下颠倒混匀。处理过的细胞放于暗室进行5～15 min放射处理，然后进行流动细胞计数分析，调节流式细胞仪参数(EX=488 nm，Em=530 nm)检测细胞凋亡情况。

1.3统计学分析采用SPSS13.0软件行t检验。

2　结　果

2.1两组大鼠进食量及体重变化第1周，两组大鼠进食量无统计学差异，1 w后实验组大鼠进食量明显下降，与对照比较差异显著，实验组食量下降一直持续到第3周。实验组体重从第4周开始逐渐较对照增大，一直持续到第8周，组间比较差异显著。见表1，表2。

2.2两组大鼠收缩压比较实验组血压与对照组比较无统计学差异。见表3。

2.3两组FPG、TG、VLDL、HDL、TC、LDL水平比较实验组FPG、TG、VLDL、HDL、TC、LDL水平高于对照组，但无显著差异。见表4。

2.411β-HSD1 mRNA和LPL mRNA水平比较实验组11β-HSD1 mRNA(1.19±0.14)高于对照组(0.85±0.32)；而LPL mRNA(1.2±0.22)低于对照组(1.7±0.42)(t=-3.25，P=0.00)。

2.5转染后3T3-L1脂肪细胞的11β-HSD1蛋白表达情况转染后3T3-L1脂肪细胞的11β-HSD1蛋白表达(0.34±0.04)远低于未转染组(1.54±0.11，t=0.124，P=0.000)。

2.6转染后3T3-L1脂肪细胞和未转染细胞用不同浓度的ASP溶液培养细胞活力的测量随着ASP溶液浓度的升高，未转染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪细胞活力逐渐上升。而转染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪细胞活力不变(分别为41%，43%，45%和42%)。

2.7转染后3T3-L1脂肪细胞和未转染细胞用不同浓度的ASP溶液培养细胞凋亡的测量随着ASP溶液浓度的升高，未转染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪细胞凋亡率逐渐下降。而转染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪细胞活力不变(分别为15%，14%，13%和14%)。

表1　大鼠不同组别进食量随时间延长的变化

与对照组比较：1)P<0.05

表2　不同组别大鼠体重随时间延长的变化

表3　不同组别大鼠收缩压随时间延长的变化

表4　不同组别大鼠在第8周血脂和血糖水平比较

3　讨　论

11β-HSD1是机体中重要的糖皮质激素代谢酶，可使无活性的泼尼松转变为有活性的氢化泼尼松，从而调节多种物质代谢。由于糖皮质激素(GC)过量所致的库欣综合征(CS)中表现的中心性肥胖和血脂异常与肥胖高脂血症类似。有研究报道，CS患者内脏脂肪的分布与11β-HSD1活性增高有关〔3〕。也有研究将脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(Ap)2前体转至正常小鼠，使11β-HSD1在脂肪组织中特异性地过度表达，可产生肥胖及高脂血症的表现，而给予11β-HSD1基因敲除的小鼠高脂喂养，其体重增加和血脂的上升程度明显低于对照〔4，5〕。这些资料提示11β-HSD1可能是导致肥胖伴高脂血症发生的重要因素。

本文发现，肥胖症模型大鼠肝脏中11β-HSD1 mRNA水平随着大鼠体重、血脂和血压的升高而升高，而脂蛋白酯酶mRNA水平却下降，从分子机制上说明11β-HSD1是导致高脂血症和肥胖的一个有效因素；脂蛋白酯酶mRNA水平下降可能是由于高脂血症、肥胖和内分泌调节导致脂蛋白酯酶mRNA含量降低，不能降解TG和其他脂类，所以导致肥胖症患者血脂升高。

ASP源于脂肪细胞，由脂肪细胞分泌的三种蛋白质补体C3、因子B、因子D在补体旁路途径中相互作用而生成。研究发现，肥胖症、糖尿病、冠心病患者血浆ASP显著升高〔6〕，并且对儿童肥胖症研究发现，血浆ASP与TG呈显著正相关〔7〕。在C3基因敲除导致ASP缺乏的小鼠模型中，餐后TG和游离脂肪酸显著升高〔8～10〕。因此，ASP在肥胖的脂代谢紊乱中也发挥促进作用。但11β-HSD1及ASP在肥胖高脂血症中的相互关系尚不明了。本文通过重组腺病毒11β-HSD1 siRNA载体构建技术构建了腺病毒载体，又将载体通过细胞转染技术转染3T3-L1脂肪细胞，随着ASP溶液浓度的升高，未转染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪细胞活力逐渐上升，而转染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪细胞活力不变；细胞凋亡变化规律与细胞活性相反。因此我们认为，ASP通过11β-HSD1基因片段对脂肪细胞进行调节，从而影响脂类代谢。

1Crombie LK，Irvine L，Elliott L，etal.Targets to tackle the obesity epidemic：a review of twelve developed countries〔J〕.Public Health Nutr，2009；12(3)：406-13.

2Brown，Hin SM，Donato KA.Bodymass index and the prevalence of hypertension and dislipidemia〔J〕.Obes Res，2000；8(9)：605-19.

3Espindola AD，Kater CE.Adipose tissue expression of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 in Cushing′s syndrome and in obesity〔J〕.Arq Bras Endocrinol Metabol，2007；51(8)：1397-403.

4Masuzaki H，Paterson J，Shinyama H，etal.A transgenic model of visceral obesity and the Metabolic Syndrome〔J〕.Science，2001；294(12)：2166-70.

5Morton NM，Holmes MC，Fievet C，etal.Improved lipid and lipoprotein profile hepatic insulin sensitivity and glucose tolerance in 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 nullmice〔J〕.J Biol Chem，2001；276(13)：41293-300.

6Cianflone K，Xia Z，Chen LY.Critical review of acylation -stimulating protein physiology in human and rodents〔J〕.Biochim Tilphys Acta，2003；16(9)：127-43.

7Wamba PC，Mi J，Zhao XY，etal.Acylation stimulating protein but not complement C3 associates with metabolic syndrome components in Chinese children and adolescents〔J〕.Eur J Endocrinol，2008；159(6)：781-90.

8Xia Z，Sniderman AD，Cianflone K.Acylation-stimulating protein (ASP) deficiency induces obesity resistance and increased energy expenditure in ob/ob mice〔J〕.J Biol Chem，2002；277(17)：45874-9.

9MacLaren R，Kalant D，Cianflone K.The ASP receptor C5L2 is regulated by metabolic hormones associated with insulin resistance〔J〕.Biochem Cell Biol，2007；85(1)：11-21.

10Katherine Cianflone，Sabin Paglialunga.Regulation of fatty acid transport and storage：influence of acylation stimulating protein〔J〕.Scand J Food Nutr，2006；50(S2)：92-8.

〔2015-11-15修回〕

(编辑徐杰)

武汉市卫生局科技课题(WX13C16)

林梅(1970-)，女，博士，主要从事糖尿病、肥胖、甲状腺疾病研究。

吴国琼(1975-)，女，在读硕士，主治医师，主要从事糖尿病、肥胖、甲状腺疾病等研究。

R589

A

1005-9202(2016)18-4435-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.014