钙蛋白酶-2和钙调神经磷酸酶蛋白表达与老年瓣膜病患者心房颤动发生的关系

李　岩　唐　芳

(石河子大学医学院第一附属医院，新疆　石河子　832008)



钙蛋白酶-2和钙调神经磷酸酶蛋白表达与老年瓣膜病患者心房颤动发生的关系

李岩唐芳

(石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832008)

目的探讨钙蛋白酶-2和钙调神经磷酸酶蛋白表达与老年瓣膜病患者心房颤动发生的关系。方法选取因瓣膜病接受瓣膜置换术的老年患者46例，收集术前临床资料，根据心律情况分为窦性心律组(20例)、房颤组(26例)。以外科换瓣手术取下的右心耳肌组织为研究标本，蛋白印迹法检测钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶蛋白表达水平。结果房颤组患者心率、服用地高辛比例均明显高于窦性心律组(P<0.05)；超声心动图检查结果显示，房颤组患者左心房内径厚度明显大于窦性心律组(P<0.05)。房颤组患者心肌组织中钙蛋白酶-2表达水平明显高于窦性心律组(P<0.05)，钙调神经磷酸酶脂蛋白催化亚基的全长分子(分子质量60 000)和不含自抑区的活性分子片段(分子质量45 000)表达水平明显高于窦性心律组(P<0.05)。结论钙蛋白酶-2-钙调神经磷酸酶信号通路参与老年瓣膜性房颤的发生。

心房颤动；钙蛋白酶-2；钙调神经磷酸酶蛋白

钙调神经磷酸酶是一种依赖Ca2+/钙调蛋白调节的蛋白磷酸酶。钙蛋白酶-2是Ca2+依赖性半胱氨酸蛋白酶，能够催化多种底物限制性水解〔1〕。钙调神经磷酸酶是钙蛋白酶-2底物之一，能被钙蛋白酶-2水解为不含自抑区结构的活化形式，活性不受Ca2+浓度调节〔2〕。最新研究显示，钙调神经磷酸酶蛋白-活化T细胞核因子信号通路参与了房颤的发生〔3〕。瓣膜性房颤主要由心腔压力改变等因素引起，与非瓣膜性房颤的传导系统退行性变化不同，钙调神经磷酸酶蛋白信号通路是否参与了瓣膜性房颤的发生尚未见报道。本研究通过检测老年瓣膜病患者右心耳组织中钙蛋白酶-2和钙调神经磷酸酶蛋白表达水平，探讨其与瓣膜性房颤发生的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2014年1月至2015年6月间来本院心外科因瓣膜病接受瓣膜置换术的老年患者46例，男27例，女19例，年龄60～78〔平均(64.82±6.39)〕岁；包括二尖瓣关闭不全8例、单纯二尖瓣狭窄4例、二尖瓣狭窄合并关闭不全11例、主动脉瓣关闭不全2例、主动脉瓣狭窄合并关闭不全2例，多瓣膜病19例。记录患者体质量、血压、心率、心电图等临床资料，根据心电图显示的心律情况分为窦性心律组(20例)、房颤组(26例)。本次研究获得本院伦理委员会审核批准，入选患者均签署知情同意书。

1.2标本采集和检测在换瓣手术建立体外循环心脏停搏之前，取患者右心耳组织，放于液氮中速冻后转移到-80℃超低温冰箱保存。采用蛋白印迹法检测右心耳组织中钙蛋白酶-2和钙调神经磷酸酶蛋白表达水平：取右心耳组织30 mg，在预冷的研钵中研磨后转入2.0 ml EP管中，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液200 μl，混合均匀，低温孵育45 min，4℃、12 000 r/min离心30 min，取上清液。BCA法测定蛋白浓度，用裂解液将各蛋白样品调节至相同浓度，加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液后120℃变性15 min，取等体积和总量的样品上样，80 V、9%～10% SDS-PAGE凝胶垂直电泳分离30 min，进入分离胶后100 V电泳60 min，4℃、100 mA电转印到PVEF膜上，置于5%脱脂牛奶Tris盐酸缓冲液(TBST)中，室温条件下封闭60 min，弃封闭液后加入一抗(鼠抗人钙调神经磷酸酶单抗、兔抗人钙蛋白酶-2多抗、鼠抗人β-actin抗体)，孵育过夜。次日，洗膜3次、10 min/次，用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠/兔二抗，104倍稀释于5%脱脂牛奶，室温孵育60 min，洗膜3次，加入化学增强发光法(ECL)发光剂，室温下反应、显影、扫描。采用发光成像分析仪测定条带的灰度值，以β-actin为内参，将其与各条带灰度值的比值作为蛋白表达的相对水平。

1.3统计学方法应用SPSS15.0统计学分析行t或χ2检验。

2　结　果

2.1两组患者临床特征比较房颤组患者心率、服用地高辛比例均明显高于窦性心律组。左心房内径厚度明显大于窦性心律组(P<0.05)；其余各项指标两组间均无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1　窦性心律组和房颤组患者临床特征比较±s)

2.2两组患者钙蛋白酶-2和钙调神经磷酸酶蛋白表达水平比较房颤组患者心肌组织中钙蛋白酶-2表达水平为(0.84±0.39)，明显高于窦性心律组(0.49±0.20)(P<0.05)。房颤组钙调神经磷酸酶脂蛋白催化亚基的全长分子(分子质量60 kD)和不含自抑区的活性分子片段(分子质量45 kD)表达水平分别为1.26±0.48、1.10±0.33，明显高于窦性心律组0.80±0.32、0.80±0.21(P<0.05)。见图1。

1、2、3为窦性心律组，4、5、6为房颤组图1　两组患者钙蛋白酶-2和钙调神经磷酸酶蛋白表达水平

3　讨　论

钙调神经磷酸酶活性受Ca2+调节，可被环孢素A等免疫抑制剂抑制，在真核生物组织中广泛存在，人体心肌组织等多种类型细胞中均有表达〔4〕。钙调神经磷酸酶由一个催化亚基和一个调节亚基共同构成，催化亚基又包括3个异构体，其中α、β存在于哺乳动物体内组织和器官中，γ存在于睾丸中〔5〕。由于钙调神经磷酸酶主要通过催化亚基发挥生物学效应，本次研究通过检测其催化亚基蛋白的表达来反映钙调神经磷酸酶蛋白表达情况。钙调神经磷酸酶催化亚基主要由4部分构成，分别为催化区、自抑区、调节区、结合区。非活化状态下，催化区被自抑区封闭，当Ca2+浓度达到一定程度时，调节区、结合区结合到催化区，使催化区构象改变，自抑区释放，催化区暴露，钙调神经磷酸酶被激活〔6〕。因此Ca2+浓度能够可逆性调控钙调神经磷酸酶表达。

本次研究中，老年瓣膜性房颤患者心肌组织中钙调神经磷酸酶催化亚基全长分子(分子质量60 000)蛋白表达水平明显高于瓣膜病窦性心律患者。结合最新研究发现，瓣膜性房颤患者的心肌组织中钙调神经磷酸酶 mRNA和活化T细胞核因子mRNA表达水平上调，推论钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路参与了瓣膜性房颤的发生〔7〕。可能机制为钙调神经磷酸酶蛋白表达上升，活性增加，而活化T细胞核因子为钙调神经磷酸酶最重要的底物，活化的钙调神经磷酸会使T细胞核因子氨基酸末端调节区域去磷酸化，暴露其定位信号而转入细胞核内，与多种转录因子共同调控相关基因的转录，参与房颤的发生。钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路中钙调神经磷酸酶的活性调节除蛋白表达提升之外，钙蛋白酶-2也可能参与。钙蛋白酶-2活化后可水解为数百种蛋白，钙调神经磷酸酶蛋白就是其中一个底物。当多种原因使细胞中的Ca2+浓度上升到一定程度时，钙蛋白酶-2被激活，进而使钙调神经磷酸酶催化亚基在N-末端第402位点出现水解，钙调神经磷酸酶失去自抑区，成为结构上的活化形式，相对分子质量为45 000，为不可逆性激活。

本次研究还证实了钙调神经磷酸酶失去自抑区蛋白表达上调，说明钙蛋白酶-2参与了钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路中钙调神经磷酸酶的活性调节。钙蛋白酶-2蛋白表达增加可能与左心房压力高、心房肌细胞内钙超载有关。

1高鹏,方全,王佳丽,等.非瓣膜病心房颤动患者抗凝不足状况及原因分析〔J〕.中华心血管病杂志,2013;41(11):931-4.

2Kim JY,Lee SJ,Kim JH,etal.Effects of atrial fibrillation on the outcome of the rehabilitation inpatients with cerebral infarction〔J〕.Ann Rehabil Med,2014;38(6):766-74.

3Furman JL,Norris CM.Calcineurin and glial signaling：neuroinflammation and beyond〔J〕.J Neuroinflam,2014,11(2):158.

4冯卫中.风湿性瓣膜病合并冠心病的外科治疗〔D〕.郑州：郑州大学,2011.

5陈景伟,程可洛.保留全瓣及瓣下结构的二尖瓣置换术治疗老年退行性瓣膜病的进展〔J〕.医学综述,2015;21(7):1248-50.

6Akkaya M,Marrouche N,Higuchi K,etal.The degree of left atrial structural remodeing impacts left ventricular rejection fraction in patients with atrial fibrillation〔J〕.Turk Kardiyol Dern Am,2014;42(1):11-9.

7赵科研,尹宗涛,李新民,等.老年瓣膜病合并重度肺动脉高压行瓣膜手术的疗效〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(21):6091-3.

〔2016-02-10修回〕

(编辑袁左鸣)

新疆建设兵团科技局2014年科技计划项目(No.2014BA036)

李岩(1975-)，女，主管护师，主要从事老年患者临床护理研究。

R54

A

1005-9202(2016)18-4454-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.022