miRNA-141在老年直肠癌患者中的表达及其与临床病理特征的关系

冯　莉　范志松　常　靓　韩　晶　王玉栋　左　静　周欣亮　王贵英

(河北医科大学第四医院肿瘤内科，河北　石家庄　050011)



miRNA-141在老年直肠癌患者中的表达及其与临床病理特征的关系

冯莉范志松常靓韩晶王玉栋左静周欣亮王贵英1

(河北医科大学第四医院肿瘤内科，河北石家庄050011)

目的探讨miRNA-141在直肠癌中的表达及其与临床病理特征的关系。方法75例直肠癌患者以及正常体检者40例纳入本次研究，收集受试者直肠癌组织及癌旁正常组织，抽取直肠癌患者及正常体检者肘静脉血，应用实时聚合酶链法检测75例直肠癌样本中miRNA-141的表达，分析直肠癌和血液miRNA-141表达与临床病理特征的关系。结果①直肠癌患者外周血和直肠癌组织miR-141的表达水平均较正常体检者显著降低(P<0.01)；② 直肠癌组织和外周血miRNA-141表达与肿瘤分期、肿瘤分化程度和有无淋巴结转移有关(P<0.01)。结论miRNA-141可能参与直肠癌发生、发展，其低表达可能与直肠癌的分化和转移有关。

微小RNA；直肠癌

肿瘤与细胞增殖、分化、凋亡调控异常密切相关。微小RNA(miRNA)是由20～25个核苷酸组成的非编码小RNA，可抑制miRNA 的翻译，并诱导miRNA的切割降解，参与细胞分裂、增殖、分化等生物学过程，具有着类似癌基因和抑癌基因的功能，在肿瘤的发生、进展过程中发挥着重要作用〔1,2〕。本文对直肠癌患者血清和癌组织miRNA-141的表达进行检测，旨在研究miRNA-141在直肠癌中的作用。

1　材料与方法

1.1临床资料2014年1～12月在本院普通外科收治的初诊直肠癌患者75例纳入本次研究。纳入标准：(1)年龄≥60岁；(2)所有患者均经过组织病理学确诊；(3)未经放疗或化疗治疗。75例患者中男43例(57.33%)、女32例(42.67%)；年龄60～72岁，平均(65.26±6.52)岁；肿瘤直径2.4～7.3 cm，平均(4.63±1.58)cm；肿瘤TNM分期Ⅰ期13例(17.33%)、Ⅱ期31例(41.33%)、Ⅲ期24例(32.00%)、Ⅳ期7例(9.34%)；黏膜下层浸润46例(61.33%)、黏膜层浸润29例(38.67%)；距肛缘距离≥5 cm 40例(53.33%)，距肛缘距离<5 cm 35例(46.67%)；高度分化16例(21.33%)、中度分化23例(30.67%)和低度分化36例(48.00%)；无淋巴结转移31例(41.33%)、有淋巴结转移44例(58.67%)。按照年龄和性别配比选取同期在本院体检中心健康体检正常的受试者40例作为对照组，年龄60～75岁，平均(66.45±5.96)岁；男22例(55.00%)、女18例(45.00%)。两组受试者年龄和性别均无统计学差异(P>0.05)。本研究得到本院伦理委员会批准，并且所有受试者均签署知情同意书。

1.2主要试剂mirVanaTMPARISTM miRNA 试剂盒，美国Applied Biosystems提供；FAST1000试剂盒，北京先锋生物公司提供；Affymetrix 逆转录试剂盒，由美国Qiagen 公司提供；Micrornas Real-time PCR Assay kit，由北京艾德莱生物科技公司；miRNA-141及内参U6引物设计与合成由北京艾德莱生物科技公司提供，miRNA-141的引物序列5'- CCGGTAACACTGTCTGGTAA-3'，内参U6的引物序列为5'- GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'。

1.3主要仪器紫外可见分光光度仪，德国Eppendorf公司提供；ABI step one荧光定量PCR仪，美国ABI公司提供；GeneGenius全自动凝胶成像系统，美国Syngene公司。

1.4方法提取受试者外周血和直肠标本的RNA，采用实时聚合酶链法(RT-PCR)测定直肠病理组织。

1.4.1RNA提取抽取受试者空腹肘静脉血5 ml，室温下静置30 min，待血液完全凝固后离心分离血清。取血清采用mirVanaTMPARISTM miRNA试剂盒提取总RNA。直肠组织RNA提取采用FAST1000试剂盒进行。称取100 mg直肠癌组织或癌旁正常组织并加入裂解液，研磨，吸取裂解液后加入氯仿进行混匀，离心，加入聚合液并转移至内套管，洗脱液洗脱2次，高速离心，将内套管移入EP内，膜中央加洗脱液RNase-free H2O，静置，离心，即得。所得RNA 经紫外分光光度法测定浓度，吸光度A260 nm/A280 nm为1.8 ～ 2.1的RNA样品于-80℃保存。

1.4.2RT-PCR采用Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit，以总RNA为模板，采用miR-141 特异性逆转录引物进行逆转录反应得cDNA。逆转录条件：16℃ 30 min；42℃ 30 min；85℃ 5 min。将逆转录所得cDNA纯化后应用Micrornas Real-time PCR Assay kit在ABI step one荧光定量PCR仪进行PCR扩增。反应总体积为20 μl∶1.5 μl cDNA 模板，1 μl miR-141或U6引物，10 μl miRNA qPCR Mix，7.5 μl H2O。PCR反应条件:94℃预变性3 min，然后94℃ 20 s、60℃ 20 s和72℃ 40 s，40 个循环。以U6 为内参基因，采用2-ΔΔCt计算miR-141 的相对定量表达水平。

1.5统计学处理使用SPSS13.0软件进行t检验、方差分析及χ2检验。

2　结　果

2.1miR-141的表达直肠癌患者直肠癌组织miR-141表达水平(5.13±0.62)较癌旁正常组织(8.67±0.95)显著降低(t=27.025，P=0.000)；直肠癌患者外周血miR-141水平(3.54±0.44)较正常体检者(6.24±0.76)显著降低(t=20.409，P=0.000)。

2.2miR-141表达与直肠癌临床病理关系的单因素分析直肠癌组织和血液miR-141表达与年龄、性别、肿瘤直径、浸润程度、距肛缘距离无明显相关性(P>0.05)；但是随着患者肿瘤分期增大，直肠癌组织和血液miR-141表达降低(P<0.01)；随着患者肿瘤分化程度降低，直肠癌组织和血液miR-141表达降低(P<0.01)；有淋巴结转移的患者较无淋巴结转移的患者直肠癌组织和血液miR-141表达降低(P<0.01)。见表1。

表1　miR-141表达与直肠癌临床病理特征的关系±s)

3　讨　论

miRNA是一系列广泛存在于动、植物中与基因表达调控相关的非编码小分子单链RNA〔3〕。miRNA为单股、长20～24 个核苷酸短序列，3′端可以有1～2个碱基的长度变化。近年来研究表明，在人类基因组中大约有900 多种独特的miRNA，并且1/3的基因由miRNAs 调控〔4〕。miRNA使mRNA的3'UTR区域完全或不完全配对来执行对靶基因的切割或者翻译的抑制功能，从而调节基因的表达〔5,6〕。miRNAs 在人类及动物的各种生理及病理过程中起重要作用，它们可以参与控制一些生物过程，包括细胞生长、凋亡、发育、新陈代谢、压力调适、激素信号通路和分化等〔7〕。miRNAs 可以根据细胞状态及不同的靶基因来决定作为癌基因或者抑癌基因，其可在多种癌症的诊断、预后及治疗中发挥重要作用〔8〕。miRNA-141是miRNA家族的成员，通过调节不同的信号通路，在生理状态和疾病发生、发展过程中发挥重要作用。miR-141 与子宫癌、前列腺癌、肝细胞肝癌、肾透明细胞癌及子宫内膜癌等的发病机制密切相关〔9,10〕。但是关于miR-141在直肠癌发病中的作用尚不完全明确。

本研究结果提示miR-141与直肠癌的发生有一定关系，血浆miR-141水平与患者短期生存率密切相关，并且可独立作为结直肠癌预后的指标〔11〕。

1Lam TK，Shao S，Zhao Y，etal.Influence of quercetin-rich food intake on microRNA expression in lung cancer tissues〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2012;21(12)：2176-84.

2Kroh EM，Parkin RK，Mitchell PS，etal.Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR)〔J〕.Methods，2010;50(4)：298-301.

3Small EM，Frost RJ，Olson EN，etal.MicroRNAs and new dimension to cardiovascular diseases〔J〕.Circulation，2010;121(18)：1022-121.

4Kim VH，Han J，Siomi MC.The Biogenesis of small RNAs in animals〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2009;10(2)：126-39.

5Davalos V，Esteller M.MicroRNAs and cancer epigenetics：a macroevolution〔J〕.Curr Opin Oncol，2010;22(1)：35-45.

6Lin PY，Yu SL，Yang PC.MicroRNA in lung cancer〔J〕.Br J Cancer，2010;103(8)：1144-8.

7Gangaraju VK，Lin H.MicroRNAs：key regulators of stem cells〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2009;10(2)：116-25.

8Iorio MV，Croce CM.MicroRNAs in cancer:small molecules with a Huge impact〔J〕.J Clin Oncol，2009;27(34):5848.

9Lee TS，Jeon HW，Kim YB，etal.Aberrant mircroRNA expression in endometrial carcinoma using formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE)tissues〔J〕.PLoS One，2013;8(12)：e81421.

10Gonzales JC，Fink LM，Goodman Jr OB，etal.Comparison of circulating MicroRNA 141 to circulating tumor cells，lactate dehydrogenase，and prostate- specific antigen for determining treatment,the response in patients with metastatic prostate cancer〔J〕.J Clin Genitourin Cancer，2011;9 (1)：39-45.

11Cheng H，Zhang L，Cogdell DE，etal.Circulating plasma MiR-141 is a novel biomarker for metastatic colon cancer and predicts poor prognosis〔J〕.PLoS One，2011;6(3)：e17745.

〔2015-11-13修回〕

(编辑李相军)

河北省卫生厅医学科学研究重点课题(No.20150769)

王贵英(1969-)，女，博士，教授，博士生导师，主要从事消化道肿瘤研究。

冯莉(1982-)，女，硕士，主治医师，主要从事消化道肿瘤研究。

R735.2

A

1005-9202(2016)18-4498-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.046

1河北医科大学第四医院外二科