二肽基肽酶Ⅱ在老年性白内障患者晶状体中表达及临床意义

吴　怡　田　蕊　李　卉　窦文文　张　辉

(吉林大学第二医院，吉林　长春　130041)



二肽基肽酶Ⅱ在老年性白内障患者晶状体中表达及临床意义

吴怡田蕊李卉窦文文张辉

(吉林大学第二医院，吉林长春130041)

目的检测二肽基肽酶(DPP)Ⅱ在不同病程的老年性白内障患者晶状体中的表达及酶活性变化，探讨DPPⅡ与老年性白内障发病的关系。方法晶状体混浊程度不同的老年性白内障患者根据晶状体核硬度不同进行分组。Western印迹法检测DPPⅡ在各组晶状体中的表达变化，应用蛋白酶活性测定DPPⅡ紫外吸光度，计算DPPⅡ在各组晶状体中的酶活性变化。结果随着老年性白内障患者晶状体核硬度的增加，DPPⅡ的表达增加，同时，DPPⅡ的酶活性增强。结论DPPⅡ随晶状体核硬度增加而呈现表达及酶活性的变化与老年性白内障进展有关。

二肽基肽酶(DPP)Ⅱ;晶状体;酶活性;老年性白内障

二肽基肽酶(DPP)Ⅱ是一种广泛分布于哺乳动物的细胞内溶酶体外切肽酶，由两个分子量为50～65 kD的亚单位组成的二聚体〔1，2〕，在细胞死亡与蛋白降解中发挥作用〔3〕。在半乳糖性白内障大鼠及SCR先天性白内障大鼠晶状体中，DPPⅡ的表达均高于正常对照组大鼠，且随晶状体混浊程度的增加，DPPⅡ的表达呈上升趋势〔4，5〕。DPPⅡ在老年性白内障患者晶状体中的表达变化尚未见报道。本研究检测不同核硬度的晶状体中DPPⅡ的表达及酶活性的变化及其与老年性白内障的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料2009年我院白内障科诊治的老年性白内障患者20例，均行小切口白内障囊外摘除术，收集术中取出的晶状体共20枚。术前已进行详细的全身检查及专科检查，排除其他类型的白内障。其中男12例，女8例；年龄65～74岁，平均71岁。根据晶状体核硬度及颜色将20枚晶状体分为A组9枚，核呈黄白色、黄色或深黄色，软核或中等硬度核。B组11枚，核呈棕色、琥珀色、棕褐色甚至黑色，硬核或极硬核。

1.2Western印迹法检测晶状体中DPPⅡ的表达 随机选取两组晶状体各1枚，在玻璃匀浆器内与1 ml蛋白裂解液混合冰上匀浆搅碎，所获混合液4℃离心(3 000 r/min，20 min)，取上清，分装，-80℃冰箱保存。聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法制定标准蛋白曲线，测定总蛋白浓度，调平后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、湿性电转、蛋白印迹及显色反应。其中，DPPⅡ一抗(1∶1 000)，4°摇床摇3.5 h，DPPⅡ二抗(1∶2 000)，室温下摇床摇2 h。二氨基联苯胺(DAB)显色液显色，照相，封存。最后利用Bandscan灰度扫描软件3次扫描后取均值。

1.3DPPⅡ在老年性白内障患者晶状体中蛋白酶活性的测定在测定液(bestatin和leuhistin的混合液)中加DPPⅡ酶样品和Tris-HCl缓冲液，37℃预孵育后加入合成底物Lys-Ala-PNA，反应5 min，加乙酸钠缓冲液(pH 4.0)、10% Tween 20，0.1%石榴红硫酸盐终止反应。5 min后用正丁醇萃取红色，用UV-2500 PC在525 nm、37℃测定紫外光密度(OD)值。按下面公式计算DPPⅡ的酶活性：活性=(OD 525×109×2.0×10-3×10)/(e×t)(nmol·min-1·L-1)。其中e为4-mβ苯胺的摩尔消光系数；t为测定时间；2.0×10-3为正丁醇的体积换算单位L；109μmol换算为nmol；×10为加的酶100 μl换算为ml。

1.4统计学处理采用SPSS20.0软件进行t检验。

2　结　果

2.1DPPⅡ在老年性白内障患者晶状体中的表达DPPⅡ蛋白条带出现在分子量约为60 kD大小的位置，B组DPPⅡ的表达较A组增加，见图1。在老年性白内障患者晶状体中，随晶状体核硬度的增加，DPPⅡ的表达增加。见表1。

图1　DPPⅡ在老年性白内障患者晶状体中的表达

组别n峰灰度总灰度Log总灰度A组99455±9811437725±2156.95±0.17B组1115267±911)16158992±4071)7.29±0.091)

与A组比较：1)P<0.05；下表同

2.2DPPⅡ在老年性白内障患者晶状体中酶活性的变化随着老年性白内障患者晶状体核硬度的增加，DPPⅡ的酶活性增强。见表2。

表2　DPPⅡ在老年性白内障患者晶状体中酶活性的变化

3　讨　论

老年性白内障是晶状体老化的退行性改变，是多种原因作用的结果，例如氧化损伤，长期紫外线照射，钙-钙蛋白异常等。晶状体中α-晶状体蛋白具有分子伴娘功能〔6〕，它能抑制酶的化学修饰并保护酶的活性，从而维持晶状体的透明性。当晶状体老化时，色素在核内蓄积〔7〕，同时不可溶性蛋白质增加〔8〕，分子伴娘作用下降，透明度降低。白内障的发生可能与晶状体中某些蛋白酶的含量及活性密切相关。早期的研究已证实DPPⅡ存在于啮齿类动物的晶状体中〔9，10〕，在大鼠、猪、牛和人的晶状体中分别检测出DPPⅡ的生化活性，并推测其与白内障发病有关〔11，12〕。本实验表明DPPⅡ在晶状体进行性混浊中发挥着某种作用。随着晶状体混浊程度的加重，αB-晶状体蛋白被切除后发生了多种化学修饰，使其可溶性成分减少，不溶性成分增加〔13，14〕。推测：晶状体中的一些关键蛋白质可被一些激活的内切肽酶降解而暴露出特异性氨基酸序列的多肽片段(如Lys-Pro，Arg-Pro等)，这些片段可能进一步被DPPⅡ等外切肽酶识别后水解或发生化学修饰，导致晶状体蛋白质结构或排列发生变化，改变晶状体蛋白质的透明性，造成白内障混浊加重，其作用及机制尚有待实验研究。

1Carrell RW，Lomas DA.Conformational disease 〔J〕.Lancet，1997；350(9071)：134-8.

2Chiravuri M，Lee H，Mathieu SL,etal.Homodimerization via a leucine zipper motif is required for enzymatic activity of quiescent cell proline dipeptidase 〔J〕.Biol Chem，2000；275 (35)：26994-9.

3Maes MB，Scharpe S，De Meester I.Dipeptidyl peptidase Ⅱ (DPPⅡ)，a review 〔J〕.Clin Chim Acta，2007；380(1-2)：31-49.

4Zhang H，Yamamoto Y，Shumiya S，etal.Peptidases play an important role in cataractogenesis：an immunohistochemical study on lenses derived from Shumiya cataract rats 〔J〕.Histochem J，2001；33(9-10)：511-21.

5田蕊，张辉，于维芹，等.二肽基肽酶Ⅱ在半乳糖性白内障大鼠晶状体中的表达〔J〕.国际眼科杂志，2008；7(4)：698-700.

6Horwitz J.Alpha-cystallin can function as a molecular chaperone 〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1992；89(21)：10449-53.

7李凤鸣.眼科全书〔M〕.北京：人民卫生出版社,1996：1611-3.

8何守志.晶状体病学〔M〕.北京：人民卫生出版社,2004：2-3,16-7.

9Sentandreu MA，Toldra F.Partial purification and characteri-sation of dipeptidyl peptidase Ⅱ from porcine skeletal muscle〔J〕.Meat Sci，2001；57(1)：93-103.

10Swanson AA，Davis RM，Meinhardt NC.Proteases in human lenses and their possible significance〔J〕.Curr Eye Res,1985；4(1)：43-8.

11Willis C，Gorthy，Daniel E，etal.Localization of the lysosomal protease dipeptidyl peptidase Ⅱ in the young normal rat lens：a correlative light and electron microscopic analysis〔J〕.Curr Eye Res，1992；11(6)：531-42.

12Willis C，Gorthy，Parviz A.Biochemical and histochemical evidence for lysosomal proteases in Rodent lenses〔J〕.Exp Eye Res，1987；44(6)：747-53.

13张辉，赵梅生，于维芹，等.αB-晶状体蛋白在先天性白内障大鼠晶状体中的免疫活性变化〔J〕.眼科新进展，2006；26(12)：893-5.

14张旭，邹尉玉.αB-晶体蛋白在半乳糖性白内障晶状体中的表达〔J〕.眼科新进展，2003；23(6)：575-8.

〔2015-02-19修回〕

(编辑苑云杰)

张辉(1966-)，女，博士，教授，主要从事白内障研究。

吴怡(1982-)，女，硕士，主治医师，主要从事白内障研究。

R776

A

1005-9202(2016)18-4570-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.084