超声辅助提取条件对红曲米中桔霉素提取效果的影响

杨　强,岳建明,王雨晨,尹　胜,张　婵,王成涛,3,*

(1.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京 100048;2.食品营养与人类健康北京高精尖创新中心,北京 100048;3.食品质量与安全北京实验室,北京 100048)



超声辅助提取条件对红曲米中桔霉素提取效果的影响

杨强1,2,岳建明1,王雨晨1,尹胜1,2,张婵1,2,王成涛1,2,3,*

(1.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京 100048;2.食品营养与人类健康北京高精尖创新中心,北京 100048;3.食品质量与安全北京实验室,北京 100048)

以红曲米为原料,研究了超声辅助法提取红曲米中桔霉素的影响因素。在单因素的实验基础上,利用响应面法优化了桔霉素的提取工艺参数,建立了二次回归模型,得到提取工艺的最佳条件:超声功率213.54 W,超声时间20.76 min,超声温度60.57 ℃。最佳工艺条件下,桔霉素含量的理论值为12.354 mg/kg,最终验证的结果为12.375 mg/kg,误差仅0.17%,表明该工艺参数可信度较高,模型可较好的预测桔霉素的提取量。

红曲米,桔霉素,超声提取,响应面

红曲是我国传统食用色素,在我国已有千年食用历史。红曲作为一种药食两用品,作为着色剂广泛应用于食品、药品、化妆品等行业,现代医学研究表明,红曲具有降低胆固醇、降血压、降血脂等营养功效[1-2]。1995年,BLANC等[3]首次报道,红曲霉次级代谢产物中含有一种较强致癌、致突变作用的真菌毒素-桔霉素,红曲安全性引起世界各国的重视。目前,红曲发酵生产过程中常伴随产生桔霉素已严重影响到红曲产品安全,成为限制我国红曲产品出口的瓶颈问题,亟待解决。

目前对于桔霉素的检测方法主要包括[4-9]:高效液相色谱(质谱)法、薄层层析法、酶联免疫法、毛细管色谱法和抑菌圈法等。然而,这些方法存在一个共同的缺陷就是对于样品的前处理方法不统一,溶剂浸提法、超声萃取、震荡、大孔树脂及微波萃取法等处理均有文献报道[10-12],桔霉素前处理的方法多样且差别较大。因此,高效、准确统一的样品前处理方法对于桔霉素检测具有重要意义。Liu、靳赛、Pattanagul、王雅芬、Wang等[13-17]在提取红曲米中桔霉素时采用的提取方法、提取溶剂、提取时间、提取顺序方面均存在差异,因此即使处理的样品种类一致,但结果依然存在一定差异。目前国际对红曲米及其相关产品中桔霉素检测的前处理没有统一标准,制定统一桔霉素检测的前处理提取方法,对于解决国际争端也有积极意义。

超声辅助提取具有提取时间短、效率高等优点,因此被广泛应用于天然产物的提取中[18-19]。本文将超声技术应用于红曲米中桔霉素提取(检测前处理),重点研究了有机溶剂、配比、料液比、超声温度、超声时间和超声功率对桔霉素提取效果的影响,并通过响应面设计优化桔霉素提取条件,寻求红曲米中桔霉素提取的快捷、高效方法,以期为桔霉素检测提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

红曲粉半夏科技有限公司;甲醇、乙腈(色谱纯)赛默飞世尔科技(北京)有限公司;桔霉素标品(纯度≥98%)sigma公司;甲酸、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、丙醇、氯仿、四氯化碳(以上试剂均为分析纯)西陇化工股份有限公司。

KQ-300DE型数控超声波清洗机昆山市超声仪器有限公司;R201型旋转蒸发器上海申胜生物科技有限公司;FW-80微型高速粉碎机北京中兴伟业有限公司;BSA224S电子天平塞多利斯科学仪器(北京)有限公司;TGL-10C高速台式离心机上海安亭科学仪器厂;LC-20AT高效液相色谱日本岛津公司。

1.2实验方法

1.2.1红曲米粉的制备红曲米干燥后采用FW-80微型高速粉碎机研磨成粉待用。

1.2.2桔霉素的测定采用HPLC法[20]。YMC-Triart C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm);荧光检测器的激发波长为λex=331 nm,发射波长λem=500 nm;乙腈∶水(磷酸调pH 2.5)=35∶65作为流动相;28 ℃柱温;1.2 mL/min流速;10 μL进样量。用甲醇溶解、稀释制备20 mg/L桔霉素标准品储备溶液,4 ℃保存。甲醇稀释储备液配置0.05～12 mg/L桔霉素溶液,HPLC检测,以峰面积与桔霉素浓度进行线性回归。

1.2.3因素条件对桔霉素提取效果的影响

1.2.3.1提取溶剂对桔霉素提取效果的影响称取0.500 g红曲米粉样品,分别用甲苯、乙酸乙酯、甲酸、甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、氯仿、四氯化碳等溶剂按照一定体积配比提取红曲米粉中桔霉素,提取温度60 ℃,超声功率210 W,料液比1∶20(g/mL),提取时间30 min。提取液经旋转蒸发仪浓缩至干,用甲醇复溶过0.45 μm有机滤膜,滤液上机测定桔霉素含量。

1.2.3.2料液比对桔霉素提取效果的影响称取0.500 g红曲米粉样品,分别以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 (g/mL)的料液比混合均匀。超声功率210 W,提取温度60 ℃,提取时间30 min。提取液经旋转蒸发仪浓缩至干,用甲醇复溶过0.45 μm有机滤膜,滤液上机测定桔霉素含量。

1.2.3.3超声温度对桔霉素提取效果的影响称取0.500 g红曲米粉样品,分别将超声提取温度设为30、40、50、60、70、80 ℃。超声功率210 W,料液比1∶20(g/mL),提取时间30 min。提取液经旋转蒸发仪浓缩至干,用甲醇复溶过0.45 μm有机滤膜,滤液上机测定桔霉素含量。

1.2.3.4超声功率对桔霉素提取效果的影响称取0.500 g红曲米粉样品,分别将超声功率设为120、150、180、210、240、270 W。提取温度60 ℃,料液比1∶20,提取时间30 min。提取液经旋转蒸发仪浓缩至干,用甲醇复溶过0.45 μm有机滤膜,滤液上机测定桔霉素含量。

1.2.3.5超声时间对桔霉素提取效果的影响称取0.500 g红曲米粉样品,分别超声提取5、10、20、30、40、50 min。超声功率210 W,料液比1∶20,提取温度60 ℃。提取液经旋转蒸发仪浓缩至干,用甲醇复溶过0.45 μm有机滤膜,滤液上机测定桔霉素含量。

1.2.4响应面优化桔霉素提取条件通过单因素实验确定影响较显著的实验因素与水平。利用软件Design Expert8.0.6中的Box-Behnken中心组合设计,见表1。对数据进行回归分析,拟合得到二次多项回归模型,并对此回归模型进行方差分析,绘制多元回归方程的响应面及其等高线。通过该组动态图对任意两因素之间交互影响的效应进行分析和评价,确定最佳水平范围,进而得到最优超声提取桔霉素的工艺参数[21]。

表1　响应面分析实验因素水平表

2　结果与讨论

2.1桔霉素标准曲线绘制

在1.2.2色谱条件HPLC检测桔霉素含量。以桔霉素浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,建立标准曲线,得到回归方程:y=1338586.204574x+112192.854990,R2=0.998819。

图1　桔霉素标准曲线Fig.1　Citrinin with standard curve

表2　不同溶剂及体积配比对红曲米粉中桔霉素提取效果的影响

2.2因素条件对超声辅助提取红曲米粉样品中桔霉素效果的影响

2.2.1溶剂对红曲米粉样品中桔霉素提取效果的影响本文实验了不同的提取溶剂及配比对红曲米粉中桔霉素提取效果的影响,实验结果如表2所示,最终验证了以甲苯-乙酸乙酯-甲酸体积比7∶3∶1为提取剂所得的桔霉素含量最高,这与许赣荣[22]的实验提取溶剂一致。

2.2.2料液比对红曲米粉样品中桔霉素提取效果的影响由图2可知,当料液比由1∶10提升到1∶20后桔霉素的提取量上升,但随着溶剂量的增加桔霉素的含量并没有继续上升,反而呈现平缓下降趋势,分析可能当料液比为1∶10时提取溶剂量少因此对红曲米粉的提取不够充分,而当提取溶剂量多时红曲米粉与溶剂的混合并不完全,因此桔霉素的含量反而降低。

图2　料液比对红曲米粉样品中桔霉素提取率的影响Fig.2　Influence of solid-liquid ratio on the extraction of Citrinin

2.2.3温度对超声辅助提取红曲米粉样品中桔霉素效果的影响由图3可知,在30～60 ℃范围内,随着温度的提高,提取液中桔霉素的含量逐渐提高。当超声温度为60 ℃时,桔霉素的含量最高,随着温度继续提升,桔霉素的含量却开始降低,分析可能由于超声波产生的热效应导致红曲米粉末中的色素成分与桔霉素的结构特性一同受到不利影响所致[22],因此出现含量下降的现象。由此可知在提取红曲色素和红曲桔霉素时,提取温度不宜设置过高,适宜的温度不仅节约能源而且利于提取充分。

图3　超声温度对桔霉素提取效果的影响Fig.3　Influence of ultrasonic temperature on the extraction of Citrinin

2.2.4超声功率对红曲米粉样品中桔霉素提取效果的影响在120～210 W范围内,随着超声功率的增大,提取液中桔霉素的含量逐渐提高,如图4所示。当超声功率为210 W时,桔霉素的含量最高,继续提高超声功率,桔霉素的含量却开始降低。这可能是由于超声功率过高,产生的空化作用使体系中聚集了一部分非色素颗粒[23],这些颗粒不仅可能对色素产生吸附,对桔霉素也产生了一定的吸附作用,因此不利于桔霉素的提取完全,从而造成桔霉素含量降低。

图4　超声功率对桔霉素提取效果的影响Fig.4　Influence of ultrasonic power on the extraction of Citrinin

2.2.5超声时间对红曲米粉样品中桔霉素提取效果的影响图5可知,在超声时间为5～50 min时,随着超声时间延长,桔霉素提取率逐渐提高。当超声20 min时,桔霉素含量基本达到较高水平,继续延长超声时间,对桔霉素提取率影响不大。分析可能是随着超声时间延长,超声波产生的热效应及空化作用抑制了溶剂体系正常的渗透压及蒸汽压,不利于桔霉素提取。LIU等[10]在检测红曲米中桔霉素含量时前处理采用50%乙醇,料液比1∶5,超声20 min;WANG等[14]在采用乙醇∶水体积比70∶30,40 ℃超声30 min,再200 r/min震荡1.5 h,进行红曲米中桔霉素提取。

图5　超声时间对桔霉素提取效果的影响Fig.5　Influence of ultrasonic time on the extraction of Citrinin

2.3红曲米粉样品中桔霉素提取条件的响应面设计优化

2.3.1响应面实验设计结果在以上因素条件对超声辅助提取桔霉素效果的基础上,选择对桔霉素提取率影响最为显著的3个因素:超声功率(A)、超声时间(B)和超声温度(C),根据Design Expert 8.0.6的中心组合实验设计原理,以桔霉素含量为响应值,进行响应面优化设计实验(表1),结果见表3。

表3　Design Expert实验设计及结果

表4　桔霉素含量回归模型方差分析

2.3.2回归方程的方差分析Design Expert 8.0.6软件对表3的桔霉素含量数据进行回归分析,拟合得到二元回归方程:桔霉素含量=12.30+0.42A+0.51B+0.30C-1.36AB-0.48AC-0.90BC-1.25A2-2.00B2-1.52C2,对此回归模型进行方差分析,其结果见表4。

2.3.3响应面分析与优化多元回归方程的响应面及其等高线见图6～图8。通过该组动态图即可对任意两因素之间交互影响的效应进行系统直观的分析和评价,并从中确定最佳水平范围。响应面是响应值对各实验因素所构成的三维空间曲面图,实验因素对实验结果影响越大,曲面越陡峭。等高线的形状可以反映两两因素之间交互作用的显著程度。圆形表示两因素交互作用不显著,而椭圆形则表示交互作用显著[23]。

图6　超声功率和超声时间交互作用的响应面Fig.6　Response surface of ultrasonic power and time

图7　超声功率和超声温度交互作用的响应面Fig.7　Response surface of ultrasonic power and temperature

图8　超声温度和超声时间交互作用的响应面Fig.8　Response surface of ultrasonic time and temperature

由图6～图8的立体响应面图及其投影等高线可直观的看出,超声功率与超声时间、超声温度两两间的交互作用显著,曲线较陡。根据Box-Behnken实验得到的结果和二次多项回归方程,利用Design Expert8.0.6软件获得了提取桔霉素含量最高时各因素的最佳参数条件:超声功率213.54 W,超声时间20.76 min,超声温度60.57 ℃。在此优化条件下,桔霉素的含量理论值为12.354 mg/kg。考虑到仪器的实际操作状态,在超声功率210 W,超声时间21 min,超声温度60 ℃的条件下,验证实验重复5次,实验结果分别为12.156、12.632、12.366、12.117、12.603 mg/kg,最终验证的结果为12.375 mg/kg,与理论预测值误差仅0.17%。相同的样品及提取溶剂,在60 ℃温度下放置21 min后的桔霉素提取含量为6.95 mg/kg,在常温下超声21 min的桔霉素提取含量为8.03 mg/kg。本实验所得提取条件下的桔霉素提取含量较二者分别提高78.06%和54.11%。

3　结论

研究了超声辅助提取条件对红曲米中桔霉素提取效果的影响,并通过响应面设计优化桔霉素提取条件。结果表明,甲苯-乙酸乙酯-甲酸体积比7∶3∶1、料液比1∶20 (g/mL)时,其桔霉素提取率最高,超声功率、超声时间和超声温度对桔霉素提取率的影响显著。响应面设计优化实验,获得桔霉素提取最佳参数条件为:超声功率213.54 W,超声时间20.76 min,超声温度60.57 ℃。在微调整后的条件下,验证实验重复5次,桔霉素检测值平均值为12.38 mg/kg,与理论预测值(12.35 mg/kg)误差仅0.17%。本文采用超声技术提取红曲米中桔霉素,并首次较为系统的研究了溶剂配比、料液比、超声温度、超声时间和超声功率对提取红曲米中桔霉素的影响,响应面法优化得到了最佳提取前处理条件,相较于复杂的提取步骤,本实验结论操作简单、提取效果明显且用时经济,这将为红曲米中桔霉素的检测及食品安全检测提供科学依据。

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Effect of ultrasound-assisted conditions on the extraction of citrinin from red kojic rice

YANG Qiang1,2,YUE Jian-ming1,WANG Yu-chen1,YIN Sheng1,2,ZHANG Chan1,2,WANG Cheng-tao1,2,3，*

(1.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China; 2.Beijing Innovation Centre of Food Nutrition and Human Health,Beijing 100048,China; 3.Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Beijing 100048,China)

The ultrasound-assisted extraction technology of citrinin from red kojic rice was studied.On the basis of single factor experiments,the technique parameters were optimized by the response surface methodology. The optimum extraction conditions were as follows:ultrasonic power 213.54 W,ultrasonic time 20.76 min,ultrasonic temperature 60.57 ℃.Under such conditions,the citrinin concentration of the extract reached the 12.375 mg/kg,agreeing with the predicted value(12.354 mg/kg),the relative error was 0.17%.Therefore,the optimized extraction procedure was reliable and the proposed prediction model could accurately predict the extraction yield of citrinin.

red kojic rice;citrinin;ultrasound-assisted extraction;response surface methodology

2016-03-14

杨强(1990-)，女，助理实验师，硕士，研究方向：食品微生物与发酵技术，E-mail：yq_0314@126.com。

王成涛(1969-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：wct5566@163.com。

国家自然科学基金项目(31301411、31401669、31571801)；北京市科技计划项目(Z151100001215008)；科技创新服务能力建设-科技成果转化-提升计划项目(PXM2016-014213-000034)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)17-0190-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.029