响应面法优化破囊壶菌油脂的超临界CO2萃取工艺研究

吴海龙,崔　岩,成家杨

(北京大学深圳研究生院,广东深圳 518055)



响应面法优化破囊壶菌油脂的超临界CO2萃取工艺研究

吴海龙,崔岩*,成家杨

(北京大学深圳研究生院,广东深圳 518055)

在单因素实验的基础上采用响应面法对破囊壶菌Aurantiochytriumsp.油脂的超临界CO2萃取工艺进行优化。优化的工艺条件为:萃取压力30.3 MPa、萃取温度64.4 ℃、CO2流速56 L/h、萃取时间2 h,在此条件下的油脂提取率达到了74.55%;油脂的主要成分为十六碳烷酸(C16∶0)和二十二碳六烯酸(C22∶6,DHA),含量分别为48.818%和35.120%。萃取出的破囊壶菌油脂成分简单,DHA含量高,可作为保健品生产的重要来源。

破囊壶菌,超临界CO2萃取,响应面法,优化设计,油脂提取

破囊壶菌是一类异养的海洋真菌,在分类学上属于不等毛门、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科。破囊壶菌体内含有大量油脂[1],其成分以DHA和十六碳烷酸为主[2],其它脂肪酸含量很少。DHA全称二十二碳六烯酸,具有促进婴幼儿智力和视力发育、预防心脑血管疾病、抑制炎症和改善视力等功效,在保健品和食品领域均有广泛的应用[3]。目前,DHA主要来源于深海鱼油,但随着渔业资源的日渐枯竭和鱼油品质的下降,从鱼油中获取DHA将难以满足社会需求[4],而破囊壶菌油脂则是DHA商业开发的潜在来源。

有机溶剂浸提法是国内外广泛应用的油脂提取法,出油率高,动力消耗小,缺点是油脂中会残留有机溶剂,影响油脂品质。超临界CO2萃取法是一种新型高效的萃取技术,萃取完成后溶剂与油脂自动分离,免除了溶剂的蒸馏分离问题,后处理简单[5]。目前,采用超临界CO2从深海鱼类[6-7]和微藻[8-9]中提取油脂已有诸多报道,但采用超临界CO2萃取破囊壶菌油脂,国内外罕见报道。

响应面法是用多元二次回归方程拟合考察因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最佳条件,在食品工业得到了广泛应用[10]。本研究以油脂提取率为评价指标,在单因素实验的基础上,选择萃取压力、萃取温度和CO2流速为考察因素,利用响应面法优化超临界CO2萃取工艺,为破囊壶菌油脂的进一步开发利用提供理论和实验依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

正己烷(色谱纯)天津市科密欧化学试剂有限公司;蛋白胨广东环凯生物科技有限公司;酵母提取粉广东环凯生物科技有限公司;葡萄糖(分析纯)天津市福晨化学试剂厂;磷酸氢二钾(分析纯)天津市大茂化学试剂厂;天然海水深圳湾海域。

HZQ-300恒温振荡器及HWS12电热恒温水浴锅上海一恒科技有限公司;BioFlo310高温灭菌台式发酵及5810R台式高速冷冻离心机德国艾本德公司;FreeZone 2.5冻干机美国Labconco公司;Agilent 7890-5975气相色谱仪美国安捷伦科技有限公司;HA220-40-11超临界二氧化碳萃取设备南通市华安超临界萃取有限公司。

1.2实验方法

1.2.1破囊壶菌的培养与菌粉的制备本研究所用的破囊壶菌菌株为Aurantiochytriumsp. PKU#SW7,由北京大学深圳藻类新能源技术研发和应用工程重点实验室从深圳海域自主采集分离得到。

液体培养基:葡萄糖20 g/L、蛋白胨1.5 g/L、酵母提取粉1 g/L、磷酸二氢钾0.25 g/L,过滤后的天然海水。固体培养基需额外添加10 g/L的琼脂。

首先从固体培养基中接种少量破囊壶菌至300 mL液体培养基中,活化培养2 d后接种到5 L发酵罐中,在温度28 ℃、转速100 r/min下进行扩大培养,4 d后收集菌液。取50 mL菌液于离心管中,4000 r/min离心5 min后收集菌体,置于冻干机中真空冷冻干燥24 h。将干燥后的菌体加入研钵中,研磨至粉末状态,用于超临界CO2萃取实验。

1.2.2油脂含量的测定称取50 mg菌粉,加入2 mL 4%硫酸-甲醇溶液,振荡30 s,80 ℃下水浴1 h。待溶液冷却到室温,各加入1 mL水和正己烷,混匀后离心[11]。取上层有机相,加入已称重的干燥玻璃管中,氮气吹干后再次称量玻璃管的重量,根据下式即可计算出油脂含量。

式中,C为油脂含量(%),W0为干燥的玻璃管重量(g),W1为加入油脂后的玻璃管重量(g),m为菌粉重量(g)。

1.2.3超临界CO2萃取破囊壶菌油脂图1为超临界CO2萃取的工艺流程。首先,取20 g菌粉于萃取釜中,打开钢瓶,CO2经冷凝后,由高压泵加压至设定压力,再经过预热器升至设定温度,进入萃取釜,不断将菌粉中的油脂萃取出来,减压后进入分离器,油脂留在分离器中,CO2经流量计排回钢瓶。萃取结束后,打开分离器的阀门,收集萃取出的油脂并称重,并按下式计算油脂提取率。

式中,E为油脂提取率(%),M1为分离器1中的油脂重量(g),M2为分离器2中的油脂重量(g),m为加入的菌粉量(g),C为油脂含量(%)。

图1　超临界CO2萃取工艺流程图Fig.1　The flow chart of SC-CO2 extraction

1.2.4单因素实验采用单因素实验考察萃取压力、萃取温度、CO2流速和萃取时间对油脂提取率的影响。单因素实验的因素和水平见表1。

表1　单因素实验因素水平表

1.2.5响应面实验设计在单因素实验的基础上,选择萃取压力、萃取温度和CO2流速为考察因素,以油脂提取率为响应值,采用Design-Expert.V8.0.6.1软件,利用响应面法(RSM)中的Box-Behnken设计(BBD),对超临界CO2萃取的工艺参数进行优化。

1.2.6油脂成分分析称取20 mg左右萃取出的油脂,加入1 mL 4%硫酸-甲醇溶液,混匀,80 ℃下水浴1 h后,各加入1 mL水和正己烷,混匀后离心。取上层有机相,用正己烷定容至20 mL,用于气相色谱分析。

色谱条件:安捷伦DB-5MS毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),FID检测器,进样口温度280 ℃,检测器温度290 ℃,进样量1 μL,分流比10∶1。升温程序:70 ℃保持2 min,以10 ℃/min速率升温至230 ℃,再以3 ℃/min速率升温至290 ℃,保持5 min。氢气流量30 mL/min,空气流量400 mL/min。对比标准样品并计算峰面积,从而确定油脂中各组分的含量。

2　结果与分析

2.1超临界CO2萃取的单因素实验

在萃取温度50 ℃、CO2流速50 L/h、萃取时间2 h的条件下,考察萃取压力对油脂提取率的影响。由图2a可知,随着萃取压力的增大,油脂提取率不断提高,但当萃取压力增加到45 MPa 时,油脂提取率基本保持不变。萃取压力的增加,减少了分子间的传质距离,提高了传质效率,有利于原料的萃取;但菌粉中的油脂含量有限,继续增加压力提取率基本不变,而且会增大对设备的损耗,增加操作和维护费用。因此,适宜的萃取压力为35 MPa。

图2　不同萃取压力(a)、萃取温度(b)、CO2流速(c)、萃取时间(d)下的油脂提取率Fig.2　Oil extraction rate on different extraction pressure,temperature,CO2 flow rate and time

在萃取压力35 MPa、CO2流速50 L/h、萃取时间2 h的条件下,考察萃取温度对油脂提取率的影响。由图2b可知,随着萃取温度的升高,油脂提取率不断提高。这是因为随着萃取温度的升高,物质的扩散系数不断增大,有利于油脂萃取。因此,适宜的萃取温度为60 ℃。

在萃取压力35 MPa、萃取温度60 ℃、萃取时间2 h的条件下,考察CO2流速对油脂提取率的影响。由图2c可知,随着CO2流速的增大,油脂提取率先增大后减小。CO2流速对萃取过程同时存在着两方面的影响。一方面,流速的增加使单位时间里CO2对菌粉的萃取次数增加,提高了传质速率[12];另一方面,当CO2流速较大时,溶质与超临界流体来不及充分作用即到达分离釜中,使得萃取率下降。因此,适宜的CO2流速为50 L/h。

在萃取压力35 MPa、萃取温度60 ℃、CO2流速50 L/h的条件下,考察萃取时间对油脂提取率的影响。由图2d可知,当萃取时间在2 h以内,随着时间的增加,油脂提取率不断提高;但当时间超过2 h后,油脂提取率曲线接近水平。因此,适宜的萃取时间为2 h。

2.2Box-Behnken实验结果与响应面分析

2.2.1实验设计与结果基于单因素实验的结果,可以看出萃取压力、萃取温度和CO2流速是对油脂提取率影响较大的因素。因此响应面分析选定的考察因素为萃取压力(X1)、萃取温度(X2)和CO2流速(X3),萃取时间设定为2 h,每个考察因素取3个水平(-1、0、+1),以油脂提取率(Y)为响应值进行Box-Behnken实验。设计因素与水平见表2,实验结果见表3。

表2　BBD设计因素水平表

表3　BBD实验设计及结果

2.2.2模型的建立与显著性检验表3中,实验号1-12是析因实验,实验号13-15是中心实验,用以估计实验误差。采用Design-Expert软件对表3的数据进行多元回归拟合,得到了萃取压力、萃取温度和CO2流速对油脂提取率的二次多项回归方程模型:

Y=-301.93875+1.30075X1+7.76025X2+3.76675X3+0.0756X1X2-0.01555X1X3-0.00625X2X3-0.0873X12-0.0753X22-0.02575X32

对该回归方程进行方差分析,结果见表4。

表4　方差分析结果

2.2.3三维效应面分析三因素两两交互作用对油脂提取率的响应面和等高线见图3。图3中,左图为响应面三维图,右图为等高线图。右图中，等高线上的数字表示响应值的大小，左图中，响应值变化越快，响应面的坡度越大。对于固定的萃取温度或者固定的CO2流速,萃取压力的升高会导致提取率的降低;对于固定的萃取压力或者固定的CO2流速,萃取温度的升高有助于油脂的提取;而对于固定的萃取压力或者固定的萃取温度,存在着一个最优的CO2流速值,过高或过低的流速都会降低油脂提取率。

为了确定最佳相应值的因素水平组合,对回归方程求一阶偏导,并令其为0,整理得到方程组,解得:X1=30.34 MPa,X2=64.42 ℃,X3=56.16 L/h。将结果代入回归方程,解得:Y=73.57%。考虑到实际操作性,将破囊壶菌油脂的最佳萃取条件修正为:萃取压力30.3 MPa,萃取温度64.4 ℃,CO2流速56 L/h,萃取时间2 h。

2.3验证实验

为了进一步验证该模型的可靠性,在最优条件下(萃取压力30.3 MPa,萃取温度64.4 ℃,CO2流速56 L/h,萃取时间2 h)进行3次实验,油脂提取率的平均值为74.55%,与73.57%的预测值接近,说明该模型可靠。

2.4油脂成分分析

对在最优条件下萃取得到的油脂进行成分分析,结果见表5。

由表5可知,油脂中共检测出9种脂肪酸,碳分子数在12～22之间,双键数目在0～6之间,有6种饱和脂肪酸,1种单不饱和脂肪酸和2种多不饱和脂肪酸,油脂组成较为简单。油脂的主要成分为十六碳烷酸和DHA,其中DHA的含量为35.12%。

表5　超临界CO2萃取出的油脂成分

图3　三因素两两交互作用对油脂提取率的响应面和等高线Fig.3　Response surface and contour showing the interactive effects of three conditions on oil extraction rate

3　结论

通过响应面法得到的二次多项回归方程模型,方差分析和验证实验均表明该模型可靠,能较好地解释油脂提取率随各参数变化的规律。优化得到的最佳萃取条件为:萃取压力30.3 MPa、萃取温度64.4 ℃、CO2流速56 L/h、萃取时间2 h,在此条件下的油脂提取率达到了74.55%。对在最佳条件下萃取出的油脂进行成分分析,结果表明油脂的主要成分为十六碳烷酸和DHA,其中DHA的含量为35.12%,远高于鱼油中12%左右的DHA含量[],可作为保健品生产的重要来源。

[1]李晶晶,刘瑛,成家杨,等. 深圳海域6株破囊壶菌的生长特性及油脂成分分析[J]. 微生物学通报,2015,42(1):17-23.

[2]李晶晶,刘瑛,马炯. 破囊壶菌生产DHA的应用前景[J]. 食品工业科技,2013,34(16):367-371.

[3]黄菊华,李蕴成. DHA的功能及在食品添加中的应用研究[J]. 中国食物与营养,2014,20(4):76-79.

[4]吴海龙,崔岩,成家杨. 破囊壶菌二十二碳六烯酸的制备工艺及应用前景[J]. 食品与发酵工业,2016,42(2):259-264.

[5]汤鹏,段海霞,夏金梅,等. 响应面法优化超临界CO2萃取鲍鱼内脏油脂及其脂肪酸种类测定[J]. 食品科学,2015,36(12):153-159.

[6]Lopes BLF,Sanchez-Camargo AP,Ferreira ALK,et al. Selectivity of supercritical carbon dioxide in the fractionation of fish oil with a lower content of EPA plus DHA[J]. Journal of Supercritical Fluids,2012,61(51):78-85.

[7]Maschietti M,Pedacchia A,Maschietti M,et al. Supercritical carbon dioxide separation of fish oil ethyl esters by means of a continuous countercurrent process with an internal reflux[J]. Journal of Supercritical Fluids,2014,86(1):76-84.

[8]Mouahid A,Crampon C,Toudji SAA,et al. Supercritical CO2

extraction of neutral lipids from microalgae:Experiments and modelling[J]. Journal of Supercritical Fluids,2013,77(77):7-16.

[9]Couto R M,Simoes P C,Reis A,et al. Supercritical fluid extraction of lipids from the heterotrophic microalga Crypthecodinium cohnii[J]. Engineering in Life Sciences,2010,10(2):158-164.

[10]杨文雄,高彦祥. 响应面法及其在食品工业中的应用[J]. 中国食品添加剂,2005(2):68-71.

[11]Kamlangdee N,Fan K W. Polyunsaturated fatty acids production by Schizochytrium sp. isolated from mangrove[J]. Songklanakarin Journal of Science & Technology,2003(25):643-650.

[12]秦昌蓉. 富油微藻中油脂的提取及DHA富集纯化的研究[D]. 天津：天津大学,2010.

[13]温雪馨,李建平,侯文伟,等. 微藻DHA的营养保健功能及在食品工业中的应用[J]. 食品科学,2010(21):446-450.

Optimization of supercritical CO2extraction of oil from thraustochytrids by response surface methodology

WU Hai-long,CUI Yan*,CHENG Jay

(Peking University Shenzhen Graduate School,Shenzhen 518055,China)

Based on the single factor experiments,the response surface methodology(RSM)was employed to optimize the conditions of supercritical CO2extraction of oils fromAurantiochytriumsp.. The optimum condition were as follow:extraction pressure of 30.3 MPa,temperature of 64.4 ℃,CO2flow rate of 56 L/h and extraction time of 2 h,under which the oil extraction rate was 74.55%. The main components of oils were palmitic acid and DHA,which were 48.818% and 35.120% of the total fatty acids,respectively. The extracted oils ofAurantiochytriumsp. had simple composition and high DHA content,which can be used as potential resources for health products.

thraustochytrids;supercritical CO2extraction;response surface methodology;optimal design;oil extraction

2016-03-14

吴海龙(1994-)，男，硕士研究生，研究方向：DHA的分离纯化，E-mail:wuhl2013@163.com。

崔岩(1984-)，女，博士，助理研究员，研究方向：微藻生物质油的提取，E-mail:cuiyan@pkusz.edu.cn。

海洋公益性行业科研专项经费项目(201305022)；深圳市战略新兴产业发展专项资金(JCYJ20150806112221114)；深圳市未来产业专项资金(JCYJ20150626110855791)。

TS224.4

B

1002-0306(2016)17-0232-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.037