560例中国结直肠癌患者K-ras基因突变研究*

姚　晖，汪杰华，李　莉，龚金兰，吴晓峰，陈风华

(上海市杨浦区市东医院　200438)



·论著·

560例中国结直肠癌患者K-ras基因突变研究*

姚晖，汪杰华，李莉，龚金兰，吴晓峰，陈风华△

(上海市杨浦区市东医院200438)

目的探讨结直肠癌患者K-ras基因突变状态并为个体化治疗提供指导。方法采用嵌套和COLD-PCR的方法分析560例结直肠癌患者K-ras基因突变状态。结果560例患者K-ras基因总体突变率27.08%，128例血浆标本突变率为0，432例组织标本突变率为27.08%。突变类型包括G12S、G12C、G12D、G12A、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L，2种不同K-ras基因突变率比较，差异有统计学意义(P<0.000 1)。362例男性患者的突变率为20.44%，包括G12S、G12C、G12D、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L；198例女性患者的突变率为21.72%，包括G12S、G12C、G12D、G12A、G12V、G13R、G13D，不同性别间K-ras基因突变率比较，差异无统计学意义(P=0.722 7)。80例年轻患者的突变率为20%，包括G12S、G12C、G12D、G12V、G13D；127例中年患者的突变率为33.07%，包括G12S、G12D、G12A、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L；353例老年患者的突变率为16.71%，包括G12C、G12D、G12V、G13R、G13D，不同年龄间K-ras基因突变率比较，差异有统计学意义(P=0.000 5)。结论560例结直肠癌患者K-ras基因突变类型主要为G12D、G12V、G13D，K-ras基因突变在不同标本类型、不同年龄间存在差异，不同性别间无差异。

结直肠癌；K-ras基因；基因突变

癌症是全球性疾病，具有高发病率，高病死率的特点[1-2]。2012年结直肠癌的病死率高达69万人[3]。科学家很早就发现结直肠癌患者存在表皮生长因子受体(EGFR)信号通路的突变，针对EGFR信号通路的靶向药物(西妥昔单抗等)得到开发，其疗效也在实践中被证实[4]。EGFR下游信号激活通路中的RAS和RAF基因，而这些基因常包含致癌突变，其中K-ras突变率为30%～60%，B-raf为5%～20%，N-ras为1%～3%[5-7]。本研究采用嵌套和COLD-PCR方法研究560例中国人结直肠癌患者K-ras基因突变状态，并比较不同标本、性别和年龄间K-ras基因突变频率的差异，为西妥昔单抗药物的使用提供参考依据。

1　资料与方法

1.1一般资料本研究使用的临床标本来自全国上百家三级医院的患者，包括128例血浆标本和432例组织标本。所有参与本研究的患者或其家属均签署授权上海赛安生物医药科技有限公司进行K-ras基因检测的知情许可同意书。

1.2仪器与试剂PCR仪购自杭州博日科技有限公司，离心机购自湘仪离心机仪器有限公司。Pfu酶和dNTP均购自上海申能博彩生物科技有限公司，DNA提取试剂盒购自Axygen Scientific Inc。PCR产物序列测定由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.3基因组DNA提取按照试剂盒说明书进行操作。

1.4COLD-PCR测序法检测K-ras基因突变采用Primer 5进行引物设计，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，嵌套和COLD-PCR测序法用于检测K-ras基因突变。(1)PCR扩增：常规PCR方法扩增465 bp大片段。所用引物：正向5′-GTC GAT GGA GGA GTT TGT AAA TGA AGT-3′，反向5′-TTC AGA TAA CTT AAC TTT CAG CAT AAT TAT CTT G-3′。10 μL PCR反应体系，包括0.25 mM的dNTP、0.5 μM的引物、0.5单位的Taq DNA聚合酶和10 ng的模板DNA。95 ℃预变性3 min，32个扩增循环：94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，然后72 ℃，保持5 min。(2)COLD-PCR：COLD-PCR方法用于扩增155 bp的小片段。所用引物：正向5′-GTC ACA TTT TCA TTA TTT TTA TTA TAA GG-3′，反向5′-TTT ACC TCT ATT GTT GGA TCA TAT TC-3′。50 μL的PCR反应体系，包括0.25 mM的dNTP、0.5μM的引物、0.5单位的Taq DNA聚合酶和1 μL的大片段PCR产物。95 ℃预变性3 min，40个扩增循环：80 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；15个扩增循环：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，然后72 ℃，保持5 min。(3)PCR产物纯化测序：由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.5统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计数资料组间比较使用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1PCR产物测序结果采用COLD-PCR测序方法，检测K-ras基因突变状态。见图1。

2.2不同类型结直肠癌患者K-ras基因突变560例患者K-ras基因总体突变率为27.08%，包括128例血浆标本和432例组织标本，血浆标本突变率为0，组织标本突变率为27.08%，突变类型包括G12S、G12C、G12D、G12A、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L，2种不同标本K-ras基因突变率比较，差异有统计学意义(P<0.000 1)。见表1。

注：COLD-PCR产物测序的代表性图谱，表示K-ras基因第13位密码子由GGC突变为GAC。

图1K-ras基因突变状态

2.3不同性别结直肠癌患者K-ras基因突变362例男性患者的突变率为20.44%，突变类型包括G12S、G12C、G12D、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L；198例女性患者的突变率为21.72%，包括G12S、G12C、G12D、G12A、G12V、G13R、G13D，不同性别K-ras基因突变率比较，差异无统计学意义(P=0.722 7)。见表1。

2.4不同年龄结直肠癌患者K-ras基因突变80例年轻患者的突变率为20%，突变类型包括G12S、G12C、G12D、G12V、G13D；127例中年患者的突变率为33.07%，包括G12S、G12D、G12A、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L；353例老年患者的突变率为16.71%，包括G12C、G12D、G12V、G13R、G13D，不同年龄患者K-ras基因突变率比较，差异有统计学意义(P=0.000 5)。见表1。

表1　　COLD-PCR测序法检测患者不同标本类型、性别、年龄的K-ras基因突变频率[n(%)]

3　讨　　论

ras家族包括H-ras、N-ras、K-ras,这些基因是人类癌症中变化最频繁的群组之一[8]。K-ras癌基因参与PI3K/PTEN/AKT和RAF/MEK/ERK的信号通路[9-10]。因此K-ras突变占人类癌症中ras突变的85%，N-ras占15%，H-ras仅占0.12%～1%[11]。

目前检测EGFR信号通路下游的癌基因(如K-ras)突变状态是必需的，目的是区分患者，并让一部分患者从抗-EGFR的疗法中获益[12-14]。此外，一些具有预后价值的基因(如B-raf)也会一起被检测，除了测序法，MALDI MS方法因高灵敏度、高特异性、检测时间短和样品处理容易而受到关注[15]。由于免疫组织化学方法对标本的要求低、费用低，也受到部分学者的应用，但由于无法区分突变型和野生型K-ras肿瘤患者而受到一定的限制，设计针对突变型K-ras的单克隆抗体也就成为将来发展的一个方向[16]。

致谢：本研究受到上海赛安生物医药科技有限公司彭南求及赵新泰教授的技术支持。

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Analysis of K-ras gene mutation status in 560 Chinese colorectal cancer patients*

YAOHui,WANGJiehua,LILi,GONGJinlan,WUXiaofeng，CHENFenghua△

(ShanghaiShidongHospital,Shanghai200438,China)

ObjectiveTo analyze the mutation status of K-ras gene in colorectal cancer patients,further more,to provide guidance for personalized therapy for colorectal cancer.MethodsNested and COLD-PCR were used to detect the K-ras mutations in 560 patients with colorectal cancer.ResultsIn 560 colorectal cancer patients,the total positive rate of K-ras gene mutations was 27.08%,the mutation rate was 0 in 128 plasma samples and it was 27.08% in 432 tissue samples.The mutate sites were G12S,G12C,G12D,G12A,G12V,G13R,G13C,G13D,Q61K,Q61L,there were significant differences existed in different samples (P<0.000 1); the mutation rate of 362 male patients was 20.44% and the types of mutation include G12S,G12C,G12D,G12V,G13R,G13C,G13D,Q61K and Q61L.The mutation frequency was 21.72% in 198 female patients,the mutation points were G12S,G12C,G12D,G12A,G12V,G13R and G13D.There were no significant difference between different sex (P=0.722 7); the mutation frequency was 20% in 80 youth patients including G12S,G12C,G12D,G12V,G13D and the mutation rate was 33.07% in 127 middle age patients,the points of mutation were G12S,G12D,G12A,G12V,G13R,G13C,G13D,Q61K,Q61L,the mutation frequency was 16.71% in 353 old age patients,the types of mutation include G12C,G12D,G12V,G13R,G13D,the difference was significant among different age patients (P=0.000 5).ConclusionThe total rate of mutations is 27.08% in 560 colorectal cancer patients,and the main points of mutation is G12D,G12V,G13D.There are significant differences in different type of samples as well as in different ages,but no statistical significance in different sex patients.

colorectal cancer;K-ras;gene mutation status

上海市卫计委重点项目(201540032)。

姚晖，男，主任医师，主要从事临床肿瘤放射治疗研究。

，E-mail:13761246568@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.022

A

1673-4130(2016)19-2715-03

2016-02-24

2016-04-19)