阴离子交换固相萃取-HPLC快速测定中药材中合成色素的方法研究

姜　伟　张　璐　傅小红　戴群芳　廖树伟

（南昌市食品药品检验所南昌330038）

阴离子交换固相萃取-HPLC快速测定中药材中合成色素的方法研究

姜伟张璐傅小红戴群芳廖树伟

（南昌市食品药品检验所南昌330038）

目的：针对中药材染色现象，建立快速测定中药材中亮蓝、柠檬黄、日落黄、赤藓红、苋菜红、诱惑红等6种合成色素的HPLC检测方法。方法：样品用甲醇-0.1％甲酸溶液提取后，再经阴离子固相萃取去除大部分基质干扰，采用Agilent C18色谱柱（4.6mm× 250mm，5μm），以甲醇-20mmol/L乙酸铵为流动相，梯度洗脱，以二极管阵列检测器测定。结果：在山茱萸、黄柏两种基质中，这6种色素在0.1μg/L至100μg/L范围内线性关系良好。检测限为0.16～1.04mg/kg，回收率为80.5％～102.9％，相对标准偏差为1.6％～4.8％。结论：本方法操作简单，结果准确可靠，重现性好，适用于中药材中多种人工色素的快速检测。

阴离子交换固相萃取 高效液相色谱 中药材 色素

中药材非法染色行为不仅严重影响中药产业的健康发展，也严重危害人民健康。研究表明，合成色素具有不同程度的致敏性和致癌性，中药材标准规定，禁止添加任何合成色素。但在利益的驱动下，中药材的非法染色行为屡禁不止，甚至药材同时使用多种色素染色，对中药材的有效监管提出了挑战，目前染色的检测大多仅适用于个别药材，中药材基质干扰严重限制了方法的通用性，2015版《中国药典》将合成色素的检测分析作为指导原则列入，但是仍缺少对色素通用的前处理方法。急需建立起多种合成色素的快速检测方法。

目前，中药材中测定合成色素的常用方法有薄层色谱法、高效液相色谱法等、示波极谱法[1～4]。中药材的染色所用合成色素多集中于水溶性色素，结构上主要分为偶氮类色素（苋菜红、日落黄等）和非偶氮类色素（赤藓红等）。本研究采用阴离子交换固相萃取法，可去除中药材基质干扰，快速测定6种不同结构类别的合成色素。

1　仪器与试药

1.12695e型高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器（Waters公司）；C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm，美国安捷伦科技有限公司）；超声仪（昆山超声仪器有限公司）；阴离子交换柱Cleanert PWAX柱（150mg/6mL，天津博纳艾杰尔科技有限公司）。

1.2甲醇（色谱纯，默克公司）、乙酸铵；甲酸、氨水（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；柠檬黄、日落黄、赤藓红、苋菜红、诱惑红、亮蓝（中国计量科学研究院）；实验用水为超纯水（自制）。

1.3山茱萸、黄柏等中药材购自南昌市场。

2　方法与结果

2.1混合对照试剂溶液的制备：取亮蓝、柠檬黄、日落黄、赤藓红、苋菜红、诱惑红对照品溶液1mL，加水制成每1mL分别含0.1mg的混合溶液，作为对照试剂溶液。精密量取对照试剂溶液适量，用水依次稀释成质量浓度为100μg/mL、50μg/mL、10μg/mL、1μg/ mL、100ng/mL的系列溶液，作为系列混合对照试剂工作溶液。

2.2供试品溶液的制备：取粗粉（过二号筛）0.5g，精密称定，置25mL具塞离心管中，用甲醇-0.1％甲酸溶液（3∶2）避光超声提取（频率：53HZ，功率：500W），第1次10mL 30min，第2次，5mL 15min，第3次，5mL10min合并上清液置25mL棕色量瓶中，用甲醇-0.1％甲酸溶液（3∶2）稀释至刻度，摇匀。

精密取上述溶液5mL，快速通过阴离子固相小柱（预先用6mL甲醇、6mLpH6.0水活化），依次用6mL水（pH6.0）、6mL甲醇淋洗，通入空气干燥5min，用2％氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用1mL水定容。

2.3液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（C18，4.6mm×250mm，5μm，美国安捷伦公司）；以甲醇为流动相A，20mmol/L乙酸铵为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为254nm。

表1　梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition

2.4通用性考察：本实验选择山茱萸、黄柏作为研究对象，山茱萸为山茱萸科果实，黄柏为黄柏树树皮，两者成分复杂，质量与颜色有密切关系，易出现非法染色的现象，具有代表性，能够考察方法的通用性。

2.5线性关系：在上述色谱条件下，6种酸性色素的液相色谱图（见图1），取系列混合对照试剂工作溶液进样测定，以各组分峰面积对浓度绘制曲线，结果表明，各色素在0.1μg/L至100μg/L范围内均有良好线性关系，相关系数均在0.999以上。

表2　6种合成色素线性回归方程以及相关系数Tab.2 Regression and correlation coefficient of 6 synthetic pigments

2.6回收率和精密度：取2种药材（山茱萸、黄柏），经检测不含上述6种酸性色素（见图2），然后分别添加低（0.1μg/mL）、中（1μg/ mL）、高（10μg/mL）3个水平的色素对照品溶液，一式3份，共9份，按“1.3”项下供试品溶液制备方法和“1.4”项下液相色谱条件进样分析，计算回收率和精密度（n=9）。6种色素3种质量浓度下加样的样品回收率在80.5％～102.9％之间（见表3）。特别是赤藓红的加标回收率由约40％提高至80％以上，完全可以满足检测回收率的要求。该方法前处理可有效去除基质干扰且对目标色素具有较好的保留，HPLC检测方法稳定可靠，耐受性良好。

2.7检测限：分析低水平添加溶液的信噪比，计算6种色素的检出限（S/N=3），结果见表3，6种酸性合成色素在黄柏和山茱萸中的检出限为0.16～1.04mg/kg范围内，检出限的差别可能由于山茱萸中的生物碱等物质易与合成色素发生相互作用。由于中药材的非法染色能达到相应的效果，色素的使用量至少要达到50mg/kg，即使考虑到多种合成色素的混合使用，该方法仍可满足禁用合成色素检查的要求。

表3　6种色素测定的回收率、精密度和检测限Tab.3 Recoveries，precision and limits of detection of 6 pigments

3　讨论

3.1提取溶剂的选择：根据合成色素的结构特点和理化性质，分别考察了0.1％甲酸溶液、甲醇-0.1％甲酸溶液（3∶2）、甲醇-0.1％甲酸溶液（2∶3）、0.1％甲酸甲醇溶液对目标合成色素的提取率，结果表明采用甲醇-0.1％甲酸溶液（3∶2）的提取效率高于其他提取溶液，重复性较好，故采用甲醇-0.1％甲酸溶液（3∶2）避光超声提取。

3.2固相萃取柱的选择：本实验研究的6种色素中赤藓红结构中含羧基，其余5种结构中含磺酸基，但多以盐的形式存在。由于多数中药材的纤维细孔状结构，易吸附合成色素。聚酰胺吸附材料能提供合成色素的反相保留能力，能有效地去除样品中杂质。但是由于赤藓红的羧酸结构保留较弱，淋洗过程中，造成赤藓红的损失，回收率低，仅为40％，不能满足检测要求。本实验比较阴离子交换固相萃取和聚酰胺固相萃取两种方法，最终确定采用阴离子交换法。该方法相对于聚酰胺法，可提高吸附酸性色素的能力，同时对赤藓红的反保留能力予以提高，可满足检测要求。故而利用商品化的阴离子交换固相萃取小柱，可实现纯化并富集酸性色素，且操作方便，重复性好。

3.3采用阴离子交换固相萃取-HPLC法，建立了中药材中诱惑红、苋菜红、赤藓红、柠檬黄、日落黄、亮蓝等6种人工合成色素的快速检测方法，操作简单，快速高效，重复性好，适用于快速测定多种中药材中不同结构的人工合成色素。

[1]颜琪.液-液分配高效液相色谱法测定饮料中合成色素[J].监督与选择，2005（10）：60-61.

[2]晏立新.食用合成色素的检验方法[J].职业与健康，2006，22（20）：1662-1663.

[3]邵仕萍，奚星林，陈洁贞，等.饮料和糖果中5种非法添加色素的检测[J]食品科学，2011，32（4）：189-192.

[4]杨胜琴，仓书华.高效液相色谱法快速测定糕点中亮蓝[J]中国卫生检验杂志，2012，22（4）：934-935.

Rapid determination of synthetic pigments in medicinal Chinese herbs by anion exchange SPE–HPLC

Jiang Wei Zhang Lu Fu Xiaohong Dai QunfangLiao Shuwei（Nanchang Institute of Food and Drug Control，Nanchang 330038，China）

Objective：To develop an HPLC method for rapid determination of six synthetic pigments，including brilliant blue，tartrazine，sunset yellow，erythrosine B，amaranth，allura red，to distinguish the dyeing from medicinal Chinese herbs.Methods：the sample were extracted by methanol-0.1％fornic acid，then purified by anion exchange solid phase extraction（SPE）.Results：A reversed phase column，C18（4.6mm×250mm，5μm）was used for determination.six pigments presented in shanzhuyu（Corni Fructus）and Huang bo（Phellodendri Chinensis Cortex）possessed good linear correlation in the concentration range from 0.1μg/mL to 100μg/mL.their quantitative detection limits ranged from 0.16mg/kg to 1.04mg/kg，and their recoveries ranged from 80.5 to 102.9％，the RSDs ranged from 1.6％to 4.8％.Conclusion：this method is simple，reliable and reproducible，and suitable for simple detections of synthetic pigments in medicinal Chinese herbs.

Nion exchange SPE HPLC Medicinal Chinese herb Synthetic pigments

R927.2

A

1672-8351（2016）10-0002-02