普通小麦几丁质酶基因的克隆与表达分析

陈冬阳，杨明明，高 翔,2，张龙龙，郭江岸，李 万

(1.西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100； 2.陕西省小麦新品种培育工程研究中心，陕西杨凌 712100)



普通小麦几丁质酶基因的克隆与表达分析

陈冬阳1，杨明明1，高 翔1,2，张龙龙1，郭江岸1，李 万1

(1.西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100； 2.陕西省小麦新品种培育工程研究中心，陕西杨凌 712100)

几丁质酶是植物重要的防卫因子之一，与植物抗病性密切相关。为深入了解几丁质酶基因表达及功能，先利用引物ChiF/ChiR从10份具有不同抗病性的小麦中克隆出几丁质酶基因后对其进行序列分析及原核表达分析，再利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析小麦根、茎和叶不同组织中几丁质酶基因的表达情况，并选取在小麦根、茎和叶中表达量最高的几丁质酶基因进行真菌性病害的抗性反应试验。结果表明，从10份具有不同抗病性的小麦中克隆得到5条长度约960 bp的几丁质酶基因序列，其中1条序列与已公布的 Chi-3基因序列(序列登录号为KJ507387)一致，其余序列命名为 Cht1～Cht4(GenBank登录号为KR049247～KR049250)。序列分析表明，克隆所得序列无内含子，编码的几丁质酶属于ClassⅠb类型，也属于糖苷水解酶第19家族，是胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。SDS-PAGE分析表明，重组质粒pE-Chi能在BL21(DE3)中表达一个33 kDa左右的特异蛋白。qRT-PCR分析表明，这5种几丁质酶基因在小麦根、茎和叶中均有表达，但在不同器官中表达量差异较大，其中，叶中表达量最高，根中次之，茎中最低；同时，这5种几丁质酶基因在同一器官中表达量大小具体表现为 Cht4> Cht2> Cht3> Cht1> Chi-3。选取相对表达量最高的 Cht4基因验证其对真菌性病害的抗性反应，结果表明，在条锈菌胁迫下， Cht4基因在抗病材料92R137中的表达量显著高于感病材料铭贤169，并且均高于同等条件下接ddH2O的表达量。本研究扩增到的几丁质酶基因在小麦中组成型表达，说明其参与了小麦的正常生长发育过程； Cht4基因的表达受条锈菌诱导，推测其可能参与了小麦叶部抗条锈菌的防御反应。

小麦；几丁质酶；原核表达；组织表达；功能分析

由真菌引起的小麦病害严重影响小麦的产量和品质。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)能够水解菌丝生长初期细胞壁中的几丁质，对真菌具有广谱抗性[1-3]。目前，已在水稻、小麦、大麦和棉花等100多种植物中检测到几丁质酶活性[4]。正常情况下，植物体内几丁质酶的含量很低，甚至不表达，但当受到病原菌侵染、病毒感染或其他非生物因素诱导时，植物体内的几丁质酶活性会迅速提高[5-6]。油菜[7]、菜豆[8]、拟南芥[9]、烟草[10]、棉花[11]和甘蔗[12]经真菌诱导后，体内的几丁质酶大量表达，并且酶活性也有所提高[13]。体外抑菌实验证明，不同的几丁质酶经过纯化后对绿色木霉菌[14]、立枯丝核菌[15-16]、灰霉病菌[17]、叶霉病菌[18]、尖孢镰刀菌[19]、赤霉菌[16]、黄萎菌[16]和赤星菌[16]等20多种病原真菌的孢子萌发和菌丝生长具有抑制作用。转基因研究表明，成功表达异源几丁质酶基因的烟草[20]、油菜[20-21]、西瓜[22]、黑杨[23]、小麦[24-25]和水稻[26-27]对真菌的抗性明显高于对照植物。说明几丁质酶基因是植物重要的防卫基因，在植物生长发育、抗逆和防御反应中发挥重要作用[3,28]。因此，利用几丁质酶基因培育抗病新品种是植物抗病性研究的热点之一。但目前基因工程中可被利用的几丁质酶基因仍很稀少[6,29-30]，几丁质酶基因在不同小麦品种中是否存在突变，及该基因在不同组织中表达量尚不明确。本研究从不同小麦品种中克隆几丁质酶基因，并利用实时荧光定量的方法研究其在小麦根、茎、叶等不同部位的表达差异，以及受条锈菌诱导后的表达量变化，验证其对真菌性病害的抗性，以期发掘小麦中的有效抗条锈病基因，为小麦的抗病分子育种提供基础材料。

1　材料与方法

1.1供试材料

供试材料共计10份，包括陕627、陕715、西农528、西农538、西农556、西农558、西农583、小偃22、铭贤169(感条锈病)和92R137(抗条锈病)，除铭贤169和92R137种子由西北农林科技大学韩德俊课题组提供外，其他材料均由本实验室保存。

1.2几丁质酶基因的克隆

所有供试材料播种于直径10 cm的花盆中，24 ℃下光照16 h/黑暗8 h培养2周，收集叶片，利用微量CTAB法[31]提取基因组DNA。根据NCBI中已公布的中国春几丁质酶基因(KJ507385)的开放阅读框，设计包含上游起始密码子和下游终止密码子的引物ChiF/ChiR(ChiF:5′-ATGAGAGGAGTTGTGGTGG-3′; ChiR:5′-CTATGCGAACGGCCTCT-3′)，并交由金斯瑞生物技术有限公司合成。以基因组DNA为模板，利用引物ChiF/ChiR进行PCR扩增。PCR扩增体系：2×TaqMaster Mix(康为世纪公司)12.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各1 μL，DNA模板100 ng，加ddH2O至25 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，61 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。回收目的片段，连接克隆载体pEASY-T1，转化入感受态细胞Trans-T1，挑选阳性单克隆送金斯瑞生物技术有限公司测序。

1.3生物信息学分析

利用NCBI中BLAST在线软件进行基因序列比对分析；利用NCBI中ORF Finder预测序列开放阅读框；利用DNAMAN 7.0进行基因序列翻译及蛋白序列比对；利用MEGA 5.0构建系统进化树；利用SignalP 4.1 Server预测氨基酸序列信号肽；利用ProtParam预测蛋白质理化性质；利用ProtScale分析蛋白质亲疏水性；利用Prosite预测氨基酸序列基序；利用NCBI中CDD在线预测氨基酸序列保守结构域；利用NPS@网站预测蛋白质二级结构；利用SWISS-MODEL软件预测蛋白质三级结构。

1.4几丁质酶基因原核表达载体的构建与诱导表达

以1.2中得到的阳性单克隆为模板，利用ChiF1/ChiR(ChiF1:5′-GAGCAATGCGGCT CGC-3′)进行PCR扩增，反应体系同1.2。回收目的片段，连接表达载体pEASY-E1，构建重组表达载体pE-Chi。转化入感受态细胞Trans-T1，挑选阳性单克隆，以ChiF1/T7 terminator primer为引物进行正反向检验并测序。将插入正确的质粒转化感受态细胞BL21(DE3)，37 ℃、200 r·min-1过夜培养，然后将菌液以1∶100的体积比重新接种新鲜LB培养基(含100 μg·mL-1Amp)，28 ℃、200 r·min-1震荡培养至OD≈0.8时，取1 mL菌液作为对照，在剩余菌液中加入IPTG至终浓度1 mmol·L-1，继续诱导12 h。收集表达蛋白，处理样品并进行12% SDS-PAGE电泳检测。

1.5几丁质酶基因的荧光定量PCR分析

田间采集西农538花后10 d的根、茎和叶，经液氮快速冷冻后于-80 ℃保存备用。将铭贤169和92R137播种于直径10 cm的花盆中，待其第一叶充分展开后，参照康振生课题组的方法进行条锈病菌的接种[32]，分别采集接菌和ddH2O处理后0、6、12、24、48和72 h的小麦叶片，经液氮快速冷冻后于-80 ℃保存备用。

利用植物总RNA提取试剂盒(Bioteke公司)提取上述-80 ℃保存组织的总RNA。采用Nondrop2000及电泳检测RNA的浓度及质量。按照Roche公司提供的反转录试剂盒说明，取1 μg总RNA进行cDNA第一链的合成，于-20 ℃保存备用。

参照克隆得到的基因组序列，利用Primer Premier 5.0设计各基因特异的荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)引物(表1)，扩增片段为75～200 bp，退火温度设定在58～62 ℃。以上述各组织cDNA为模板，以小麦肌动蛋白基因β-actin(AB181991.1)为内参，进行qRT-PCR分析。反应体系10 μL，包含Fast Start Essential DNA Green Master 5 μL，5 μmol·L-1混合引物1 μL，cDNA模板4 μL。扩增程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，35个循环；65～95 ℃缓慢上升，其中，每0.5 ℃读取一次荧光信号，通过溶解曲线鉴定扩增产物。每个样品设置3个重复。采用2-ΔΔCt法分析实验数据，确定基因的相对表达量[33]。

2　结果与分析

2.1小麦几丁质酶基因的克隆及核酸序列分析

分别以10个小麦品种的基因组DNA为模板，利用引物ChiF/ChiR进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，得到约为1 000 bp的单一条带，将目的条带切胶回收、克隆和测序后，得到5条不同序列。

利用NCBI在线BLAST工具对所得序列进行同源性搜索，结果表明，所有序列与已公布的几丁质酶基因序列相似度较高，达99%以上，其中，1条序列与胡周波等[34]分离得到的 Chi-3基因序列(序列登录号为KJ507387)完全相同，初步断定本研究扩增得到的序列均为几丁质酶基因。将4条新基因序列命名为 Cht1～ Cht4，并将其提交至GenBank数据库，得到的序列登录号为 KR049247～KR049250。进一步比对发现，这四条序列在185～225 bp之间有两个碱基插入/缺失突变区(图1)，这两个区域的变化碱基数是三的整数倍，因此只能造成个别氨基酸的插入/缺失，不会造成移码突变。除此之外的其他位点也存在多个碱基差异。

表1　qRT-PCR分析所用引物Table 1　Primers in qRT-PCR analysis

图1　几丁质酶核酸序列主要差异区域Fig.1　Major differences in chitinase DNA sequences

2.2推导的蛋白序列分析

2.2.1理化性质分析

ORF Finder在线预测可知，新扩增到的4条序列均有完整的开放阅读框，无内含子。SignalP Server预测可知，4条蛋白序列均含有由前20个氨基酸组成的信号肽，并且属于分泌蛋白。ProtParam预测可知，4个蛋白均属于稳定蛋白。ProtScale分析可知，除了信号肽及150～200位置的氨基酸外，疏水性区域和亲水性区域分布比较均匀，但是亲水性氨基酸含量高于疏水性氨基酸，因此4个蛋白属于亲水性蛋白。此外，根据酶切位点的不同，这4条几丁质酶属于内切酶，水解位点为同聚物内部的β-1,4-糖苷键。

利用Prosite分析几丁质酶氨基酸序列的模体结构，发现扩增得到的4条几丁质酶序列N端具有20个氨基酸组成的信号肽，富含8个半胱氨酸的几丁质结合区(20～61 aa)、可变区和保守的催化区(VSFKTALWFWM)，缺少C端延伸区，编码蛋白应归属于ClassⅠb型几丁质酶；结合NCBI中CDD在线预测得到编码蛋白属于糖苷水解酶第19家族，因此，推测这4个编码蛋白具有几丁质酶和溶菌酶的双功能活性。

2.2.2结构分析

利用NPS@网站预测几丁质酶蛋白序列中的α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规卷曲等二级结构，结果表明，无规则卷曲比例最高，达到62.50%左右；延伸链为19.69%左右；α-螺旋最少，约占17.81%；不含其他二级结构。

在SWISS-MODEL网页提交几丁质酶基因的氨基酸序列，在蛋白结构库中搜索比对模板，得到2dkv.1.A序列与KR049250氨基酸序列的21到320残基一致性达74.07%，具备同源建模的条件。从而得到KR049250等4个几丁质酶蛋白的三维结构模型(图2)，该蛋白由一个双叶α+β折叠模体组成[35]。

图2　几丁质酶蛋白序列的三级结构预测Fig.2　3D structure prediction of chitinase protein sequence

2.3系统进化分析

利用DNAMAN 7.0进行基因序列翻译及氨基酸序列比对，结果(图3)显示，克隆得到的4条氨基酸序列相似度极高，主要依据2个位点出现的插入缺失进行区分。此外，KR049250氨基酸序列与小麦(CAA53626.1)的同源性为96.57%，与黑麦(AAG53610.1)的同源性为47.04%，与水稻(AAM08773.1)、拟南芥(AAM14810.1)、苦瓜(AAM18075.1)、大荨麻(P11218.3)和陆地棉(AAP80801.1)的同源性分别为12.35%、37.58%、10.89%、38.64%和30.79%。

用MEGA 5.0将获得的4条蛋白序列与其他类型的几丁质酶蛋白序列构建系统进化树，结果(图4)显示，本研究得到的蛋白与ClassⅠ型几丁质酶亲缘关系最近，应归属于此类；此外与ClassⅡ类几丁质酶亲缘关系相对较近，但与其他种类的几丁质酶亲缘关系较远。

实线框示信号肽位置；圆点框示区分4个几丁质酶基因的位点；短线框示保守催化位点

Bold wireframe indicates signal peptide; Dot frame indicates the sites to distinguish 4 chitinases; Short-term frame indicates catalytic

图3几丁质酶基因编码氨基酸的序列比对分析

Fig.3Alignment of the deduced amino acid sequences of chitinase

“★”代表本研究中4条几丁质酶基因推导得到的蛋白

“★” indicates the deduced proteins of 4 chitinase genes obtained in this study

图4几丁质酶氨基酸序列的系统进化树分析

Fig.4Phylogenetic analysis of chitinase amino acid sequences

2.4小麦几丁质酶基因的原核表达

将去掉信号肽的核酸序列连接至载体pEASY-E1，构建重组表达载体pE-Chi，并在感受态细胞BL21(DE3)中诱导表达。结果(图5)发现，28 ℃、200 r·min-1震荡培养至OD≈0.8时加入IPTG至终浓度1 mmol·L-1，表达效率最高，得到分子量约为33 kDa大小的特征条带，与推测得到的蛋白分子量大小一致，而作为对照未诱导的菌株未表达此蛋白，说明小麦几丁质酶基因在大肠杆菌中得到正确表达。

M：Blue Plus Protein Marker；1：未诱导的重组质粒；2～5：诱导的重组质粒KR049247、KR049248、KR049249和KR049250

M:Blue Plus Protein Marker; 1:Protein of recombinant plasmid without induction; 2-5:Protein of recombinant plasmid KR049247,KR049248,KR049249 and KR049250 after induction

图5诱导表达产物的SDS-PAGE分析

Fig.5SDS-PAGE analysis of protein expression

2.5小麦几丁质酶基因的表达特性分析

2.5.1小麦几丁质酶基因的组织表达特性

以小麦花后10 d的根、茎和叶cDNA为模板，利用qRT-PCR技术对 Cht1～Cht4和 Chi-3基因的表达特性进行了分析。结果(图6、图7)显示，在以上3种组织中均能检测到这5种基因的转录表达，但各基因在不同组织中的表达量存在较大差异，其中，叶中表达量最高，根中次之，茎中最低。同时也可发现，不同基因在同一组织中的表达量大小具有一定的规律，具体表现为 Cht4> Cht2> Cht3> Cht1> Chi-3。

M:D2000 DNA marker； a、b和c分别代表一次重复

M:D2000 DNA marker; a,b and c represent three replicates,respectively

图6qRT-PCR产物检测

Fig.6Detection of qRT-PCR products

图7　小麦根(a)、茎(b)和叶(c)中几丁质酶基因的表达分析Fig.7　Expression analysis of chitinase in wheat′s root (a),stem (b) and leaf (c)

2.5.2小麦几丁质酶基因在条锈菌侵染后的表达特性

以感病品种接ddH2O后0 h的基因表达量为对照，研究在正常情况下表达量最高的 Cht4基因在条锈菌诱导下的表达量变化。结果(图8)显示，92R137(抗病品种)和铭贤169(感病品种)在接种ddH2O后叶片中的 Cht4基因表达量变化不大；而在条锈菌诱导条件下两者的 Cht4基因表达量均呈现先上升后下降的变化趋势，不过铭贤169中变化没有92R137明显。在锈菌处理后叶片中的 Cht4基因表达量迅速升高，6 h时达到峰值，此时92R137中 Cht4基因表达量是对照的12.5倍，而铭贤169中 Cht4基因的表达量仅是对照的6.33倍。随着诱导时间的延长，几丁质酶基因表达量逐渐下降，至胁迫72 h后92R137和铭贤169叶片中 Cht4基因的表达量分别是对照的3.23倍和2.75倍，仍然维持较高水平。

3　讨 论

随着对几丁质酶生化性质、作用机理及表达调控的深入研究，利用其培育抗病新品种成为植物抗真菌病害研究的热点之一[6]。本研究在10个不同小麦品种中均克隆到几丁质酶基因，为进一步分析小麦几丁质酶对病原真菌的抑制作用以及植物抗病基因工程提供了材料。对序列进行分析表明，本研究得到的几丁质酶基因兼具溶菌酶活性，并且无内含子。而有研究[36]表明，当发生外界胁迫或mRNA剪切功能障碍时，对于几丁质酶基因不含内含子或含内含子很少的植物体仍能快速合成几丁质酶，不会影响其正常生理功能。

RCK:92R137接种ddH2O; RT:92R137接种条锈菌; SCK:铭贤169接种ddH2O; ST:铭贤169接种条锈菌

RCK:92R137 induced by ddH2O; RT:92R137 induced byPucciniastrilformis;SCK:Mingxian 169 induced by ddH2O; ST:Mingxian 169 induced byPucciniastrilformis

图8条锈菌处理后 Cht4基因的表达分析

Fig.8Expression analysis of Cht4 gene induced byPucciniastrilformis

本研究获得的几丁质酶具有几丁质结合区、可变交联区和催化区，而不含C端延伸区，属于ClassⅠb类型。亚细胞定位预测该几丁质酶将分泌于胞外，与已知的ClassⅠb类型几丁质酶分泌于胞外的研究[37-38]一致。很多病原菌初期侵染发生在寄主植物的细胞间隙，胞外的ClassⅡ类几丁质酶通过分解病原真菌的几丁质，产生信号分子，促成包括几丁质酶在内的病程相关蛋白的大量表达[4]，但ClassⅡ类几丁质酶几乎没有抑菌作用，而抑菌效果最好的Ia类几丁质酶大部分定位于液泡[39]。因而本研究得到的几丁质酶既能够迅速的对病原真菌的侵染做出反应，又能充分发挥其抑菌作用，增强植物抗病性。此外，本研究中几丁质酶基因在大肠杆菌中的成功表达，有利于其体外活性的分析及蛋白结构的研究，对几丁质酶在工业上的发展也有促进作用[34]。

几丁质酶主要分布于植物的根、茎、叶、花、种子以及愈伤组织中[40-42]，但不同组织中的含量不同[4]。如番茄中1种几丁质酶在花柱中含量较高，而叶中含量很低[43]； Ghachi3和 Ghachi4基因在棉花的根、茎、叶、花和种子中均有表达，但在花和韧皮部中表达量较高，而在木质部和子房中表达量较低[11]； ScChiⅦ1基因在甘蔗芽中表达量最高[12]。本研究中几丁质酶基因在根、茎、叶中均存在转录表达，说明这些基因为组成型表达，可能参与了小麦正常生长发育过程。所有基因均在叶中的表达量最高，根中其次，茎中最低，推测这些几丁质酶基因更多的参与对小麦叶部病害的防御反应。不同组织中 Cht4基因的表达量均为最高，推测其在该组同工酶中发挥作用时贡献最大。而对于是否是由于185～225 bp间的两个碱基插入/缺失突变区，造成这几种几丁质酶含量的显著差异还需要进一步探究。该实验结果与 Wch1基因在中国春茎中表达，而在叶和根中未表达结果[44]不一致，可能是因为抗性不同的小麦品种中几丁质酶含量有所差异，并且植物体在接种条锈菌后会影响未经接种部位几丁质酶基因的表达。

抗性不同的品种在受到病原真菌侵染后，抗病品种中几丁质酶含量高，而感病品种中表达量低或不表达[45-46]。不同抗性的小麦品种在受到叶锈菌[47]、腥黑穗病菌[48]、条锈菌[49]侵染后，抗病小麦中几丁质酶基因的表达活性明显高于感病品种。本研究中， Cht4基因在不同抗性品种以及同一抗性品种不同时间的表达水平具有明显差异。受条锈菌诱导后， Cht4基因在92R137和铭贤169中的表达量较对照都有所升高，推测该基因能够受条锈菌诱导表达，是小麦抵抗条锈菌侵染的非特异性抗性基因。该结果与中国春近等基因系接种条锈菌后，不亲和组合中小麦叶片 Wch1基因表达上调结果一致，可见，条锈病菌能诱导不同的几丁质酶基因表达，间接证明了几丁质酶在抗条锈病中的作用。接种条锈病菌后， Cht4基因在铭贤169中的变化比92R137中缓慢、表达量低，可能是由于铭贤169启动防御反应的信号转导比92R137慢，使得其体内的几丁质酶表达量相对较少，给病原真菌侵染提供可能，造成其表现为感病。此外，在本研究中 Cht4基因在92R137和铭贤169接种条锈菌后均出现上调表达，并且反应时间较 Wch1基因短，而 Wch1基因只在亲和组合中受条锈菌诱导，推测 Cht4基因抑制病原菌生长更加有效。但是该几丁质酶基因在抗病机制中的贡献究竟有多少尚不清楚，还有待于通过基因沉默、过表达等技术进一步深入研究。

[1]夏 伟,张 红,颜艳伟,等.棘孢木霉L4对立枯丝核菌的拮抗机制 [J].植物保护学报,2010,37(5):477-478.

Xia W,Zhang H,Yan Y W,etal.Rivalry mechanisms ofTrichodermaasperellumaL4 toRhizoctoniasolani[J].JournalofPlantProtection,2010,37(5):477-478.

[2]吴志刚,朱旭芬.几丁质酶的分子生物学特性及其在转基因植物中的应用 [J].生命科学,2002,14(2):117-121.

Wu Z G,Zhu X F.Molecular biology characterization and application in transgenic plant for chitinase [J].ChineseBulletinofLifeSciences,2002,14(2):117-121.

[3]Emani C,Garcia J M,Lopata F E,etal.Enhanced fungal resistance in transgenic cotton expressing an endochitinase gene fromTrichodermavirens[J].PlantBiotechnologyJournal,2003,1(5):321-336.

[4]欧阳石文,赵开军,冯兰香,等.植物几丁质酶的研究进展 [J].生物工程进展,2001,21(4):30-34.

Ouyang S W,Zhao K J,Feng L X,etal.Advances in research of plant chitinases [J].ProgressinBiotechnology,2001,21(4):30-34.

[5]Linthorst H J,Van Loon L C.Pathogenesis-related proteins of plants [J].CriticalReviewsinPlantSciences,1991,10(2):123-150.

[6]陈爱葵,庄文宋,陈冬梅.植物几丁质酶及其基因工程研究进展 [J].广东教育学院学报,2010,30(3):47-52.

Chen A K,Zhuang W S,Chen D M.Advances in the research on genetic engineering of plant chitinase [J].JournalofGuangdongEducationInstitute,2010,30(3):47-52.

[7]Rasmussen U,Bojsen K,Collinge D B.Cloning and characterization of a pathogen-induced chitinase inBrassicanapus[J].PlantMolecularBiology,1992,20(2):277-287.

[8]Roby D,Broglie K,Cressman R,etal.Activation of a bean chitinase promoter in transgenic tobacco plants by phytopathogenic fungi [J].ThePlantCell,1990,2(10):999-1007.

[9]Samac D A,Hironaka C M,Yallaly P E,etal.Isolation and characterization of the genes encoding basis and acidic chitinase inArabidopsisthaliana[J].PlantPhysiology,1990,93(3):907-914.

[10]Fukuda Y,Ohme M,Shinshi H.Gene structure and expression of a tobacco endochitinase gene in suspension cultured tobacco cells [J].PlantMolecularBiology,1990,16(1):1-10.

[11]杨郁文,张保龙,倪万潮,等.两个棉花几丁质酶基因的克隆与表达分析 [J].棉花学报,2008,20(2):88-93.

Yang Y W,Zhang B L,Ni W C,etal.Molecular cloning and expression analysis of two chitinase in upland cotton [J].CottonScience,2008,20(2):88-93.

[12]王珊珊,苏亚春,杨玉婷,等.甘蔗几丁质酶基因ScChiⅦ1 的克隆与表达分析 [J].热带作物学报,2014,35(2):289-298.

Wang S S,Su Y C,Yang Y T,etal.Molecular cloning and expression analysis of chitinase geneScChiⅦ1 in sugarcane [J].ChineseJournalofTropicalCrops,2014,35(2):289-298.

[13]梁美霞,李景富,许向阳,等.几丁质酶基因在植物抗真菌病基因工程中的应用 [J].黑龙江农业科学,2004(5):29-31.

Liang M X,Li J F,Xu X Y,etal.Chitinases and its application in anti-fungal gene engineering [J].HeilongjiangAgriculturalSciences,2004(5):29-31.

[14]Schlumbaum A,Mauch F,Voegeli U,etal.Plant chitinases are potent inhibitors of fungal growth [J].Nature,1986,324(6095):365-367.

[15]朱 慧,王云霞,胡白石,等.产酶溶杆菌OH11菌株几丁质酶基因的克隆与表达 [J].南京农业大学学报,2008,31(1):47-50.

Zhu H,Wang Y X,Hu B S,etal.Cloning and expression of a chitinase gene fromLysobacterenzymogenesstrain OH11 [J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity,2008,31(1):47-50.

[16]刘宝业,梁国鲁,张增艳.水稻几丁质酶的原核表达、复性及体外抑茵活性的研究 [J].核农学报,2009,23(3):369-374.

Liu B Y,Liang G L,Zhang Z Y.Prokaryotic expression,refolding and antifugal activity of a rice chitinaseinvitro[J].JournalofNuclearAgriculturalSciences,2009,23(3):369-374.

[17]Huang C J,Wang T K,Chung S C,etal.Identification of an antifungal chitinase from a potential biocontrol agent,bacilluscereus28-9 [J].BiochemistryandMolecularBiology,2005,8(1):82-88.

[18]Lee K Y,Heo K R,Choi K H,etal.Characterization of a chitinase gene exhibiting antifungal activity from a biocontrol bacteriumBacilluslicheniformisN1 [J].PlantPathology,2009,25(4):344-351.

[19]仲 健,朱 沙,张 琦.葡萄几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达及其生物活性研究 [J].河南农业科学,2009(5):90-93.

Zhong J,Zhu S,Zhang Q.Expression and functional analysis of grape chitinase inPichiapastorisGS115 [J].JournalofHenanAgriculturalSciences,2009(5):90-93.

[20]Broglie K,Chet I,Holliday M,etal.Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogenRhizoctoniasolani[J].Science,1991,254(5035):1194-1197.

[21]蓝海燕,张丽华,刘桂珍,等.导入β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因可育油菜及其抗菌核病的研究 [J].生物工程学报,2000,16(2):142-146.

Lan H Y,Zhang L H,Liu G Z,etal.Studies on transgenic oilseed rape (Brassicanapus) plants transformed with β-1,3-glucanase and chitinase genes and its resistance toSclerotiniasclerotiorium[J].CriticalReviewsinPlantSciences,2000,16(2):142-146.

[22]王果萍,王景雪,孙 毅,等.几丁质酶基因导入西瓜植株及其抗病性鉴定研究 [J].植物遗传资源学报,2003,4(2):104-109.

Wang G P,Wang J X,Sun Y,etal.Transformation of watermelon plants with chintinase gene and evaluation forFusariumwilt resistance [J].JournalofPlantGeneticResources,2003,4(2):104-109.

[23]孟 亮,李红双,金德敏,等.转几丁质酶基因黑杨的获得 [J].生物技术通报,2004(3):48-51.

Meng L,Li H S,Jin D M,etal.Transformation ofPopulusdeltoidswith CH5B gene [J].BiotechnologyBulletin,2004(3):48-51.

[24]牛吉山,郑 磊,洪德峰,等.转水稻几丁质酶基因小麦的获得和白粉病抗性鉴定 [J].河南农业大学学报,2008,5(42):483-486.

Niu J S,Zheng L,Hong D F,etal.Obtaining of transgenic wheat of rice chitinase gene and the powdery mildew assessment [J].JournalofHenanAgriculturalUniversity,2008,5(42):483-486.

[25]叶兴国,程红梅,徐惠君,等.转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶双价基因小麦的获得和鉴定 [J].作物学报,2005,31(5):583-586.

Ye X G,Cheng H M,Xu H J,etal.Development of transgenic wheat plants with chitinase and β-1,3-glucosanase genes and their resistance toFusariumHeadBlight[J].ActaAgronomicaSinica,2005,31(5):583-586.

[26]Nishizawa Y,Nishio Z,Nakazono K,etal.Enhanced resistance to blast (Magnaporthegrisea) in transgenicjaponicarice by constitutive expression of rice chitinase [J].TheoreticalandAppliedGenetics,1999,99(3-4):383-390.

[27]袁红旭,许新萍,张建中,等.转几丁质酶基因( RC24)水稻中大2号抗纹枯病特性研究 [J].中国水稻科学,2004,18(1):39-42.

Yuan H X,Xu X P,Zhang J Z,etal.Characters of resistance to rice sheath blight of zhongda 2,a transgenic rice line modified by chitinase gene(RC24) [J].ChineseJournalofRiceScience,2004,18(1):39-42.

[28]Vellicce G R,Díaz Ricci J C,Hernández L,etal.Enhanced resistance toBotrytiscinereamediated by the transgenic expression of the chitinase gene ch5B in strawberry [J].TransgenicResearch,2006,15(1):57-68.

[29]高丽美,李永锋,徐子勤.水稻碱性几丁质酶基因表达载体pCAMBIA 1301- RC24的构建 [J].山西师范大学学报:自然科学版,2009,23(3):82-86.

Gao L M,Li Y F,Xu Z Q.Construction of the expression vector pCAMBIA 1301- RC24 carrying chitinase gene [J].JournalofShanxiNormalUniversity:NaturalScienceEdition,2009,23(3):82-86.

[30]王步云,李 聪,王涌鑫,等.紫花苜蓿几丁质酶基因MsChiⅣ克隆及序列分析 [J].分子植物育种,2009,7(2):347-354.

Wang B Y,Li C,Wang Y X,etal.Cloning and characterization ofMsChiⅣ gene fromMedicagosativaL.[J].MolecularPlantBreeding,2009,7(2):347-354.

[31]Murray M G,Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA [J].NucleicAcidsResearch,1980,8(19):4321-4326.

[32]康振生,李振岐.洛夫林10常温致病新菌系的发现 [J].西北农学院学报:自然科学版,1984,12(4):18-28.

Kang Z S,Li Z Q.Discovery of a normal type new pathogenic strain to Lovrin 10 [J].JournalofNorthwestAgricultureCollege:NaturalScienceEdition,1984,12(4):18-28.

[33]Livak K J,Schmittgenb T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ct method [J].Methods,2001,25(4):402-408.

[34]胡周波,高 翔,陈其皎,等.普通小麦中国春Chi基因的克隆、染色体定位及原核表达 [J].西北农业学报,2014,23(8):25-33.

Hu Z B,Gao X,Chen Q J,etal.Cloning,chromosomal localization and prokaryotic expression ofChigenes from wheat cultivar Chinese Spring(TriticumaestivumL.) [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2014,23(8):25-33.

[35]Hart P J,Pfluger H D,Monzingo A F,etal.The refined crystal structure of an endochitinase fromHordeumvulgareL.seeds at 1.8A resolution [J].JournalofMolecularBiology,1995,248:402-413.

[36]蓝海燕,陈正华.几丁质酶及其研究进展 [J].生命科学研究,1998,2(3):163-171.

Lan H Y,Chen Z H.Advances in plant chitinase research [J].LifeScienceResearch,1998,2(3):163-171.

[37]Shinshi H,Neuhaus J M,Ryals J,etal.Structure of a tobacco endochitinase gene:evidence that different chitinase genes can arise by transposition of sequences encoding a cysteine-rich domain [J].PlantMolecularBiology,1990,14(3):357-368.

[38]Kunze I,Nilsson C,Adler K,etal.Correct targeting of a vacuolar tobacco chitinase inSaccharomycescerevisiae-post-translational modifications are dependent on the host strain[J].BiochimicaetBiophysicaActa:GeneStructureandExpression,1998,1395(3):329-344

[39]Legrand M,Kauffmann S,Geoffroy P,etal.Biological function of pathogenesis-related proteins:Four tobacco pathogenesis-related proteins are chitinases [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceoftheUnitedStatesofAmerica,1987,84(19):6750-6754.

[40]陈崇顺,徐凤彩,李明启.21科41种(变种)植物叶片几丁质酶系的研究 [J].植物资源与环境,1993,2(4):28-33.

Chen C S,Xu F C,Li M Q.Studies on the chitinase system in leaves from 41 plant species (var.) related 21 families [J].JournalofPlantResourcesandEnvironment,1993,2(4):28-33.

[41]Flach J,Pilet P E,Jolles P.What’s new in chitinase research [J].CellularandMolecularLifeSciences,1992,48(8):701-716.

[42]赵光洁,王志英,赵述禹.几丁质酶及其在转基因植株内活力的测定及定位 [J].山西林业科技,2009,38(1):40-43.

Zhao G J,Wang Z Y,Zhao S Y.Introduction of chitinase,determination and location of its activity in transgenic plant [J].ShanxiForestryScienceandTechnology,2009,38(1):40-43.

[43]Leah R,Skriver K,Knudsen S,etal.Identification of an enhancer/silencer sequence direction the aleurone-specific expression of a barley chitinase gene [J].PlantJournal,1994,6(4):579-789.

[44]Liao Y C,Kreuzaler F,Fischer R,etal.Characterization of a wheat Class Ib chitinase gene differentially induced in isogenic lines by infection withPucciniagraminis[J].PlantScience,1994,103(2):177-187.

[45]李和平,钟永旺,赵纯森,等.小麦几丁质酶基因 Wch2的克隆与表达分析 [J].植物生理与分子生物学学报,2003,29(4):347-352.

Li H P,Zhong Y W,Zhao C S,etal.Cloning and expression analysis of a wheat chitinase gene Wch2 [J].JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology,2003,29(4):347-352.

[46]Hietala A M,Kvaalen H,Schmidt A,etal.Temporal and spatial profiles of chitinase expression by Norway spruce in response to bark colonization byHeterobasidionannosum[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2004,70(7):3948-3953.

[47]Anguelova-Merhar V S,Westhuizen V D,Pretorius Z A.β-1,3-glucanase and chitinase activities and the resistance response of wheat to leaf rust [J].JournalofPhytopathology,2001,149(7-8):381-384.

[48]Lu Z X,Gaudet D,Puchalski B,etal.Inducers of resistance reduce common bunt infection in wheat seedlings while differentially regulating defence-gene expression [J].PhysiologicalandMolecularPlantPathology,2005,67(3):138-148.

[49]Mohammadi M,Roohparvar R,Torabi M.Induced chitinase activity in resistant wheat leaves inoculated with an incompatible race ofPucciniastriiformisf.sp.tritici,the causal agent of yellow rust disease [J].Mycopathologia,2002,154(3):119-126.

Cloning and Expression Analysis of Chitinase Genes in Common Wheat (TriticumaestivumL.)

CHEN Dongyang1,YANG Mingming1,GAO Xiang1,2,ZHANG Longlong1,GUO Jiang’an1,LI Wan1

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;2.New Varieties Cultivation of Wheat Engineering Research Centre of Shaanxi Province,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Chitinase,an important defensive factor in plants,is closely related to plant disease resistance. In order to understand the expression and function of chitinase genes,by the using of primer ChiF/ChiR,chitinase genes were cloned by PCR from 10 wheat cultivars with different resistance to disease in this study. After that,these sequences were analyzed by different biology software,and were expressed inE.coli.The expression of these genes in root,stem and leaf were analyzed by quantitative real-time PCR. The highest expression of chitinase gene in these tissues was selected to test the resistance with fungal diseases. The result showed that 5 chitinase gene sequences (960±3 bp in length) were cloned from 10 wheat cultivars with different resistance to disease. Of them,one sequence is consistent with the published Chi-3 gene sequence with the accession number KJ507387,and the others were named Cht1 to Cht4 with the accession numbers of KR049247 to KR049250,respectively.Sequence analysis showed that the chitinase genes in this research have no intron,encoding chitinase belonging to ClassⅠb type. The chitinase are the members of glycoside hydrolase family 19,which are extracellular secreted protein and have lysozyme activity. The results of SDS-PAGE showed that the recombinant plasmid pE-Chicould express a 33 kDa protein after induction in BL21(DE3).The results of quantitative real-time PCR showed that these five kinds of chitinase genes were expressed in wheat roots,stems and leaves. However,the amount of expression in different organs are quite different. The content of each chitinase gene in this experiment is highest in leaf,followed by root,and is minimum in stem. Meanwhile,the expression of these five kinds of chitinase genes in the same tissue is ranked as: Cht4> Cht2> Cht3> Cht1> Chi-3. Therefore, Cht4 gene,which has the maximum content in the same organ,was selected to validate its resistance to fungal diseases. The results showed that under the stripe rust stress,the expression of Cht4 gene in 92R137 (resistant material) was significantly higher than in Mingxian 169 (susceptible material),and both of them were higher than control. In this study,the chitinase genes are constitutively expressed in wheat,indicating their participation in the regular growth and development of wheat. The expression of Cht4 gene is induced by stripe rust,suggesting that it may be involved in the defense reaction for stripe rust in wheat leaves.

Wheat; Chitinase; Prokaryotic expression; Gene expression; Function analysis

时间：2016-05-10

2015-12-10

2016-01-20

“十二五”农村领域国家科技计划项目(2011AA100501)；国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-3-2-47)

E-mail：chendongyang1990@163.com

高 翔(E-mail：gx@nwsuaf.edu.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)05-0539-10

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160510.1623.002.html