超高效液相色谱-高分辨质谱法测定蜂蜜中的苯甲酸、山梨酸、安赛蜜与糖精钠

陈丽娟，费晓庆*，谭梦茹，吴　斌，沈崇钰，张　睿，丁　涛，刘　芸，杨功俊

(1.江苏出入境检验检疫局　食品实验室，江苏　南京　210001;2.中国药科大学　药学院，江苏　南京　211198)



超高效液相色谱-高分辨质谱法测定蜂蜜中的苯甲酸、山梨酸、安赛蜜与糖精钠

陈丽娟1，费晓庆1*，谭梦茹2，吴斌1，沈崇钰1，张睿1，丁涛1，刘芸1，杨功俊2

(1.江苏出入境检验检疫局食品实验室，江苏南京210001;2.中国药科大学药学院，江苏南京211198)

建立了蜂蜜中苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠的超高效液相色谱-高分辨质谱分离测定方法。样品采用甲醇-水溶液(10∶90)提取，Diamonsil Plus C18色谱柱进行色谱分离，以0.5 mmol/L乙酸铵溶液和甲醇为流动相梯度洗脱，通过高分辨负离子扫描模式进行定性，外标法定量。结果表明，4种物质在0.02～2.0 mg/L范围内均具有良好的线性关系，相关系数为0.998 7～0.999 7。苯甲酸、山梨酸的方法定量下限为0.5 mg/kg，安赛蜜、糖精钠为0.3 mg/kg 。在低、中、高3个加标浓度下，方法的回收率为89.0%～104.0%，相对标准偏差(RSD)为2.0%～7.9%。该方法灵敏、简单、快速，定性准确可靠，适用于大批量蜂蜜中苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠的检测。

蜂蜜；高分辨质谱；超高效液相色谱；防腐剂；甜味剂

苯甲酸和山梨酸作为常见的防腐剂，因良好的防腐效果被广泛用于各类食品中。虽然人体肾脏具有排毒功能，但长期且同时食用含有多种防腐剂的食物会对人体产生如贫血、神经系统的损坏和导致癌症[1]等多种毒害作用。安赛蜜和糖精钠作为非营养性甜味剂具有甜度高、用量少等特点，因而备受食品生产厂商青睐，但其安全性问题一直是消费者关注的焦点[2]。

一些不法厂家为降低成本，谋取利益，在糖浆中添加防腐剂、甜味剂、色素和香精，制成掺假蜂蜜，这种掺假行为严重干扰了蜂产品市场秩序。蜂蜜的产品标准GH/T 18796-2012中明确规定“蜂蜜中不得添加当前明确或者不明确的添加物”[3]。食品添加剂的限量标准GB 2760-2014中也规定了各类食品中苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠的使用限量[4]，但未对蜂蜜产品进行规定。已有的关于这4种物质的检测标准中[5-9]，检测的样品基质包括酱油、果酱、饮料、乳制品、饲料等，并未涉及蜂蜜。所以亟需建立一种能够快速、简单地同时检测蜂蜜中苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠的分析方法。

目前苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠的主要检测方法有紫外分光光度法、气相色谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法[10-16]。其中紫外分光光度法操作较简单，但方法灵敏度较低，定量不准确，易造成假阳性结果。气相色谱法具有较高的选择性和灵敏度，但操作步骤繁琐，需衍生，分析时间长。常规的高效液相色谱法和毛细管电泳法的操作耗时，检出限相对较高。液相色谱-质谱法在食品检测中应用较普遍，该法一般基于保留时间和质量数进行定性，接近保留时间和质量数的物质对被分析物质会存在干扰，可能导致假阳性。高分辨质谱利用一级质谱进行筛查，依靠提取精确质量数和保留时间进行定性，理论质量数与实际测得的质量数相对偏差越小，检测结果可信程度越高，抗干扰能力越强，假阳性可能越低。目前使用高分辨质谱法同时检测蜂蜜中防腐剂和甜味剂的研究尚未见文献报道和标准方法发布。

本实验采用甲醇-水溶液(10∶90)提取蜂蜜中的苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠，使用高分辨质谱同时检测这4种物质，相对于紫外分光光度法、毛细管电泳法和高效液相色谱法，该方法的检出限明显降低，能够满足日常检测要求且适合大批量样品的快速检测。采用本方法首次对国内纯正蜂蜜样本和抽检样本进行分析，从而为我国有关部门进一步开展蜂蜜的品质监管工作提供了科学根据和数据基础，在保护消费者利益方面具有重要作用。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

Q-Exactive 四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱及DIONEX UltiMate 3000 超高效液相色谱仪(Thermo Fisher公司，美国)；Option-Q超纯水仪(Elga公司，美国)。

甲醇、乙酸铵(色谱纯，Merck公司)；苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠标准品(纯度均大于99.0%，Dr.Ehrensorfer)；天然纯正蜂蜜样本共246个，来自国内蜂蜜企业和蜂农，油菜蜜36个、洋槐蜜33个、椴树蜜29个、荆条蜜28个、百花蜜25个、枣花蜜22个、荞麦蜜15个、葵花蜜13个、棉花蜜10个、进口蜂蜜35个(包括麦卢卡蜂蜜、桉树蜜、黑森林蜜等)；市场抽检蜂蜜共276个，来自国内各大超市及蜂蜜生产企业。

1.2溶液配制

单标储备液：分别称取标准品各25 mg(精确至0.01 mg)于25 mL容量瓶中，苯甲酸、山梨酸以乙醇定容，安赛蜜、糖精钠以水定容，配成1.0 g/L标准储备液，于4 ℃冷藏条件下保存。

混合标准工作溶液：准确量取适量的标准储备液，用甲醇-水(10∶90)溶液逐级稀释，得到20 mg/L的混合标准工作溶液，于4 ℃冷藏条件下保存。

1.3样品前处理

准确称取(1±0.01) g蜂蜜样品于10 mL容量瓶中，用甲醇-水(10∶90)溶液定容至刻度，涡旋溶解混匀后，过0.22 μm聚醚砜滤膜，待测定。

1.4UPLC条件

色谱柱：Diamonsil Plus C18(5 μm×150 mm×4.6 mm，Dikma公司)；柱温：室温；流速：0.60 mL/min；进样量：10 μL。流动相：0.5 mmol/L乙酸铵溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脱程序：0～1 min，5%B；1～4 min，5%～90%B；4～6.5 min，90%B，6.5～7 min，90%～5%B；7～8 min，5%B。分析时间8 min。

1.5质谱条件

加热源温度300 ℃，毛细管温度350 ℃，喷雾电压3 000 V(负离子模式)，质量扫描范围m/z100～1 000，一级质谱全扫描分辨率35 000，C-trap最大容量(AGC) 3×106，C-trap最长等待时间200 ms。

2　结果与讨论

2.1前处理方法的优化

由于本方法前处理简单，在提取过程中添加剂几乎无损失，所以对可能造成提取损失的滤膜进行优化。考察了孔径0.22 μm尼龙滤膜、0.45 μm聚醚砜滤膜、0.22 μm聚醚砜滤膜对4种化合物回收率的影响，结果发现，此3种滤膜对苯甲酸、山梨酸基本无吸附作用；但0.22 μm尼龙滤膜对安赛蜜、糖精钠有吸附，损失可达50%，其他两种滤膜对这两种物质无吸附作用。考虑到保护仪器，实验选择0.22 μm聚醚砜滤膜。

图1　苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜标准品的UPLC-Q Exactive 色谱图Fig.1　Chromatograms of UPLC-Q Exactive for benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium and acesulfame-K standards

2.2色谱-质谱条件的优化

高效C18柱是UPLC分析较常用的一类色谱柱，如Kinetex 2.6u C18(Phenomenex)、Atlantis T3(Waters)、Diamonsil Plus C18(Dikma)。实验比较了这3种色谱柱对苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠的分离效果，发现苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠在3种色谱柱上均可有效分离。但在实际检测中，Kinetex 2.6u C18(Phenomenex)和Atlantis T3(Waters)的使用寿命较短，当样品检测数量较大时，使用15～20 d会出现峰形较差、严重拖尾以及分峰的现象，而相同检测样本数量下Diamonsil Plus C18(Dikma)的使用寿命可达4～5个月且价格低廉，因此，实验最终选用Diamonsil Plus C18(Dikma)作为色谱分离柱(图1)。

同时考察了使用乙腈作为流动相时的分离情况，该条件下苯甲酸和山梨酸的峰形过宽，拖尾严重；而改用甲醇作流动相后峰形明显改善。使用纯水作为流动相水相时，高浓度标准溶液的峰形不佳；以5 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相水相时，峰形明显改善，但出峰时间较晚，当乙酸铵浓度为0.5 mmol/L时，4种化合物的出峰时间明显提前，继续降低乙酸铵浓度至0.1 mmol/L时，安赛蜜、糖精钠的出峰时间均在1 min内，不能有效保留。因此，实验最终选用甲醇-0.5 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相。

由于本文考察的化合物或含有羟基(—OH)，或以K+，Na+盐形式存在，在极性溶剂中，易失去H+，K+，Na+等离子，形成带负电荷的基团，因此适合在负离子模式下检测。用Q Exactive以全扫模式进样分析，对得到的总离子流图提取可能产生的离子质荷比，发现含Na+或K+的糖精钠、安赛蜜会同时产生多个离子，选取质荷比响应最高的作为定量离子。由于本方法利用一级质谱进行筛查，依靠提取精确质量数进行定性，因此理论质量数与实际测得值的相对偏差越小，检测结果可信程度越高。由于高分辨质谱为新开发仪器，目前暂无准确的定性偏差指标，所以将化合物实测质荷比(m/z)与理论值相差不超过±1×10-5定性为相同物质。阳性样品可通过与标准物质的保留时间和精确质量数比对来进一步定性定量。4种化合物的UPLC-Q Exactive MS分析参数见表1。

表1　4种化合物的UPLC-Q Exactive MS分析参数Table 1　UPLC-Q Exactive MS parameters of four compounds

2.3线性关系、检出限与定量下限

将20 mg/L的4种物质混合标准溶液稀释配制成2.0,1.0,0.5,0.2,0.1,0.05,0.02 mg/L的系列标准溶液，在最佳条件下进行检测，以标准品的峰面积(Y)为纵坐标，对应的质量浓度(X,mg/L)为横坐标，绘制标准工作曲线。将4种物质的混合标准溶液不断稀释至信噪比S/N=3，以此进样浓度为检出限(LOD)，以10倍信噪比对应的加标水平为定量下限(LOQ)，结果见表2。4种物质在0.02～2.0 mg/L范围内线性关系良好，相关系数(r2)不低于0.998 7，防腐剂苯甲酸和山梨酸的LOD和LOQ分别为0.2 mg/kg和0.5 mg/kg，甜味剂安赛蜜、糖精钠的LOD和LOQ分别为0.1 mg/kg和0.3 mg/kg。

表2　4种化合物的回归方程、相关系数、线性范围、检出限及定量下限Table 2　Regression equations,correlation coefficients(r2),linear ranges,LODs and LQDs of four compounds

2.4回收率与相对标准偏差

以阴性蜂蜜样品加标的回收率考察方法的准确度，以回收率的相对标准偏差(RSD)考察方法的精密度。在阴性蜂蜜样品中添加4种化合物混合标准溶液，加标水平分别为0.5，1.0，2.0 mg/kg，每个添加水平平行测定6个样品，其回收率和RSD见表3。方法的平均回收率为89.0%～104.0%，RSD为2.0%～7.9%。说明本方法的精密度和准确度良好。

表3　蜂蜜样品中4种化合物的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3　Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of four compounds in blank honey(n=6)

2.5实际样品分析

采用本方法对246个天然蜂蜜样品和276个市场抽检蜂蜜样品进行分析。天然纯正蜂蜜中有11个油菜蜜检出苯甲酸，含量为0.6～1.3 mg/kg，而其他纯正样本均不含4种分析物，推测这是由于油菜对苯甲酸有一定的富集效应，但有待于进一步研究。市场抽检蜂蜜样品中有32个样品检出苯甲酸，含量为10.5～433.9 mg/kg，苯甲酸含量明显高于上述纯正油菜蜜；11个样品检出安赛蜜，含量为8.5～160.2 mg/kg。采用已有的蜂蜜掺假检测技术标准[17]和实验室内部方法对检出苯甲酸和安赛蜜的市场抽检样品进行验证，结果表明这些样本均为掺假蜂蜜。

3　结　论

本文建立了一种简单、准确、快速、灵敏、环境友好的超高效液相色谱-高分辨质谱测定蜂蜜中苯甲酸、山梨酸、安赛蜜和糖精钠的方法。高分辨质谱在样品分析中能够消除基质干扰，提高分析定性的准确性。该方法适用于蜂蜜中防腐剂和甜味剂的测定，用于蜂蜜实际样品的检测，能有效考察苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠在蜂蜜中的添加情况。

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Determination of Benzoic Acid，Sorbic Acid，Acesulfame-K and Saccharin Sodium in Honey by Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry

CHEN Li-juan1，FEI Xiao-qing1*，TAN Meng-ru2，WU Bin1，SHEN Chong-yu1，ZHANG Rui1,DING Tao1，LIU Yun1，YANG Gong-jun2

(1.Laboratory of Food，Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing210001，China；2.College of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing211198，China)

A method based on ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry was developed to separate benzoic acid，sorbic acid，acesulfame-K and saccharin sodium in honey.The targeted compounds in honey samples were extracted with methanol-water mixtures(10∶90),and separated on a Diamonsil Plus C18column with 0.5 mmol/L ammonium acetate-methanol as mobile phase by gradient elution.The qualitative and quantitative analyses were operated under t-MS2by high resolution mass spectrometry with the external standard method.The results indicated that four analytes had good linearities in the concentration range of 0.02-2.0 mg/L with correlation coefficients of 0.998 7-0.999 7.The quantilition limits for benzoic acid，sorbic acid,acesulfame-K and saccharin sodium were 0.5，0.5，0.3,0.3 mg/kg，respectively.The recoveries of four compounds at three spiked levels were in the range of 89.0%-104.0%，with relative standard deviations(RSDs) of 2.0%-7.9%.The method was simple and rapid，and was suitable for the determination of benzoic acid，sorbic acid and acesulfame-K，saccharin sodium in honey.

honey；high resolution mass spectrometry(HRMS)；ultra high performance liquid chromatography(UPLC)；preservative；sweetener

2016-03-11；

2016-04-06

国家质检总局科技计划项目(2015IK138)；江苏出入境检验检疫局科技计划项目(2015KJ31)；国家自然科学基金资助项目(21275162)

费晓庆，硕士，高级工程师，研究方向：食品分析与食品掺假鉴别，Tel：025-52345193，E-mail：dii01208@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.012

O657.63;S482.294

A

1004-4957(2016)09-1142-05