丁苯酞对缺血大鼠大脑皮质中钙通道Cav1.3表达的影响

郭 森， 朱 江， 王永为， 杨松鹤， 孔祥玉



丁苯酞对缺血大鼠大脑皮质中钙通道Cav1.3表达的影响

郭 森1， 朱 江2， 王永为1， 杨松鹤1， 孔祥玉1

目的 探讨丁苯酞对脑缺血大鼠大脑皮质中钙通道Cav1.3表达的影响及其脑保护作用的机制。方法 雄性Wistar大鼠36只，随机分为假手术组、缺血对照组和丁苯酞治疗组，每组12只。采用免疫组织化学方法和蛋白质印迹法分别检测各组大鼠大脑皮质中钙通道Cav1.3表达的情况。采用TUNEL 法观察大鼠大脑皮质内细胞凋亡的情况。结果 与缺血对照组比较，丁苯酞治疗组大鼠大脑皮质中钙通道Cav1.3表达有所增加(P<0.05)，但仍低于假手术组(P<0.05)，大脑皮质中凋亡神经元数量丁苯酞治疗组明显少于缺血对照组但多于假手术组(P<0.05)。结论 丁苯酞可以抑制缺血造成的脑皮质中钙通道Cav1.3表达的减少，减少缺血后大脑皮质中的神经元凋亡。

丁苯酞； 脑缺血； 大脑皮质； L型钙通道； 大鼠

L型钙通道是电压依赖型钙通道，可进一步分为Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4 4个亚型。Cav1.3钙通道主要分布于中枢神经系统，参与钙稳态、激素分泌、基因表达和突触可塑性等多种功能的调控，并在神经元的存活和死亡中有重要作用[1]。

丁苯酞(n-butylphthalide，NBP)，是我国具有独立自主知识产权的国产I 类化学新药，可以通过提高脑血流量、抗神经细胞凋亡、抑制氧化应激、减轻脑水肿等诸多途径对抗缺血后所造成的神经元损伤[2～5]。多年以来对其作用机制的研究一直广受关注，本项目应用免疫组织化学和蛋白印迹的方法，对丁苯酞在脑组织缺血过程中神经元钙通道Cav1.3表达方面的影响进行研究，以探讨丁苯酞在脑缺血过程中通过钙通道Cav1.3途径发挥保护作用的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组及用药 SPF级Wistar成年健康雄性大鼠，200～220 g，36只大鼠随机分为3组，假手术组、缺血对照组和丁苯酞治疗组，每组12只，其中6只用于制作免疫组化标本，6只用于制作蛋白印迹标本。缺血组大鼠阻断左侧椎动脉和双侧颈总动脉。假手术组只暴露左侧椎动脉和双侧颈总动脉，不予阻断。丁苯酞治疗组大鼠术后，使用玻璃注射器进行腹腔注射丁苯酞注射液(2ml/kg)，其余各组大鼠给予等量的生理盐水腹腔注射。

1.2 主要药品及试剂 丁苯酞氯化钠注射液(中国石家庄制药集团有限公司)，兔源性抗Cav1.3抗体(购自abcam公司)，生物标记的山羊抗兔IgG抗体(购自北京中杉金桥公司)，小鼠源性抗β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体、总蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒、ECL化学发光底物(均购自武汉博士德公司)，TUNEL试剂盒(购自罗氏公司)。

1.3 大鼠脑缺血模型的制备 结扎双侧颈总动脉：Wistar大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg)，仰位固定于手术操作台上，颈部正中切口，钝性分离胸锁乳突肌及气管旁血管和神经，暴露双侧颈总动脉并结扎切断，检查无活动性出血后，用生理盐水和青霉素(1×105U/L)冲洗后缝合伤口。

电凝左侧椎动脉：Wistar大鼠俯位固定于手术操作台上，于第1颈椎水平沿后正中线切开皮肤，逐层分离肌肉，暴露第1颈椎横突孔，将高频电刀的电凝刀头插入左侧横突孔内电凝椎动脉2 s，重复一次。检查无活动性出血后，用生理盐水和青霉素(1×105U/L)冲洗后缝合伤口。苏醒后，保温饲养24 h。

1.4 标本的采集

1.4.1 免疫组化标本的采集 各组大鼠于相应时段后，腹腔内注射10%的水合氯醛麻醉(350 mg/kg)，开胸行主动脉插管，以200 ml生理盐水经主动脉快速冲洗，随后灌入4%多聚甲醛400 ml，固定，取出脑组织。组织后固定一夜，30%蔗糖中浸至组织下沉后行冠状切面冷冻切片(厚40 μm)。

1.4.2 Western blot标本的采集 各组大鼠于相应时段后，腹腔内注射10%的水合氯醛麻醉(350 mg/kg)，迅速断头取脑，PBS清洗血液，滤纸吸干表面液体，分提出大脑皮质，称重，组织匀浆，提取蛋白，BCA法对蛋白进行定量。蛋白样品-80 ℃保存。

1.5 免疫组织化学染色 切片在0.01 mol/L PBS中漂洗10 min×2，含0.3%H2O2的PBS中30 min灭活内源性过氧化物酶，PBS中漂洗10 min ×3，含5%山羊血清2%BSA(Bovine Serum Albumin)的PBST(含0.1%TritonX-100 的0.01 mol/L PBS)封闭2 h，兔源性抗Cav1.3抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜，切片在PBST中漂洗15 min × 4，生物标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶400)室温孵育1 h，PBST中漂洗10 min×3，亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(1∶100)室温孵育1 h，PBS中漂洗10 min×3，在0.05% DAB 显色液(0.05% DAB，0.03% H2O2，0.01 mol/L PBS缓冲液) 显色7 min，贴片后，常规脱水、透明、封片。

1.6 Western blot步骤 6%SDS-PAGE凝胶电泳(120 V，2.5 h)，转膜(300 mA，2 h)，蛋白上样量100 μg，5%BSA中封闭2 h，兔源性抗Cav1.3抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜，TBST漂洗10 min×3，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体(1∶2000)室温孵育1 h，TBST漂洗10 min×3，ECL超敏发光液显影。

1.7 细胞凋亡检测 按原位细胞凋亡检测试剂盒提供的实验步骤进行，DAB显色。细胞核中有黄褐色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。

1.8 图像分析 免疫组织化学染色和细胞凋亡检测的图像采集时，严格保持照相条件的一致。照片输入Image-Pro Plus 6.0图像处理软件，进行图像处理。免疫组织化学染色照片，各组均取相同皮质部位，分析皮质染色的平均光密度。细胞凋亡检测的照片，各组均取相同皮质部位，计数阳性细胞个数。

蛋白印迹的胶片扫描后，采用Image-Pro Plus 6.0软件对显影条带进行分析，以目的条带和β-actin条带的IOD比值作为目的蛋白的相对表达水平。

2 结 果

2.1 钙通道Cav1.3 免疫组织化学染色 切片中钙通道Cav1.3被染成棕黄色颗粒，位于细胞质内。假手术组大鼠大脑皮质各层中均有大量钙通道Cav1.3表达(见图1A)；缺血对照组大鼠大脑皮质中各层中钙通道Cav1.3表达明显减少(见图1B)；丁苯酞治疗组大鼠大脑皮质中钙通道Cav1.3表达与缺血对照组相比有明显增加，但仍少于假手术组(见图1C)(见表1)。

2.2 TUNEL法检测凋亡细胞 切片中细胞核中有黄褐色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。各组皮质中均可见TUNEL阳性细胞，假手术组阳性细胞数量较少，且染色较浅边界不清(见图1D)；缺血对照组大鼠大脑皮质中TUNEL阳性细胞数量多，染色深边界清晰(图1E)；丁苯酞治疗组皮质中TUNEL阳性细胞数量较缺血对照组有所减少，但仍明显多于假手术组(见图1F)。各组间TUNEL阳性细胞数量差异有显著性(P<0.05)(见表1)。

组别钙通道Cav1.3染色OD值凋亡细胞假手术组缺血对照组丁苯酞治疗组336.82±53.14123.03±19.58*204.68±16.27*△16.37±3.2839.14±4.03*26.83±3.92*△

与假手术组比较*P<0.05，与缺血对照组比较△P<0.05

A：假手术组钙通道Cav1.3表达；B：缺血对照组钙通道Cav1.3表达；C：丁苯酞治疗组钙通道Cav1.3表达；D：假手术组凋亡细胞；E：缺血对照组凋亡细胞；F：丁苯酞治疗组凋亡细胞

图1 大鼠大脑皮质钙通道Cav1.3免疫组织化学染色和TUNEL凋亡细胞检测

2.3 蛋白印迹检测钙通道Cav1.3表达 大鼠大脑皮质中钙通道Cav1.3表达情况(见图2、图3)，丁苯酞治疗组大鼠大脑皮质中Cav1.3与β-actin IOD比值明显大于缺血对照组大鼠(P<0.05)，但仍小于假手术组大鼠(P<0.05)，提示丁苯酞对于缺血后大鼠脑组织中的钙通道Cav1.3有保护作用。

1：假手术组；2：缺血对照组；3：丁苯酞治疗组

与假手术组比较*P<0.05；与缺血对照组比较△P<0.05

3 讨 论

在缺血性神经元损伤的过程中，细胞内Ca2+超载是公认的启动细胞损伤的关键因素。而细胞外的Ca2+内流是形成胞内Ca2+超载的主要原因。L-型钙通道是电压依赖性钙通道，有α1、α2、β、δ和γ5个亚单位组成。根据编码α1亚单位的基因，L-型钙通道又可分为Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4 4种类型。其中Cav1.3在中枢神经系统有着较为广泛的分布，其在Ca2+超载过程中的作用一直广受关注[2～5]。以往有研究显示，缺血状态下大鼠大脑皮质中的L-型钙通道开放明显增加，提示L-型钙通道可能是Ca2+内流的主要通道[6]。同时L-型钙通道拮抗剂在缺血早期对神经元保护作用的相关研究也支持上述观点[7]。

但在本研究中L-型钙通道Cav1.3在大鼠大脑皮质中的表达并未随缺血损伤的加重而增加，反而呈现出表达减少的趋势。出现这一现象可能基于下述两个原因。(1)L-型钙通道Cav1.3在正常神经元中参与多种重要的生理功能，如神经元的基因调节，神经元的发育过程等。Hirtz等在他们的研究中就曾指出，钙通道Cav1.3在小鼠与听觉相关的脑干发育过程中起重要作用[8]。Nunez-Santana等的研究也显示，在年老大鼠的海马中钙通道Cav1.3总的表达是减少的[9]。缺血会对神经元的正常功能造成严重的影响。这种影响的机制是多方面的，而钙通道Cav1.3功能和表达的改变是很难被我们排除在这些机制以外的。特别是在持续的慢性缺血过程中，钙通道Cav1.3的变化很可能不同于急性缺血性损伤，它对神经元的影响也不会只局限于Ca2+超载这一个方面，其在正常神经元中所参与的生理功能的紊乱可能是造成神经元损伤更重要的机制。(2)对于Ca2+在缺血性神经元损伤中的作用，近期也有了一些不同的观点，认为降低胞内Ca2+，反而会促进凋亡。已有报道指出，大脑皮质神经元长期接触L-型钙通道拮抗剂，使胞内Ca2+降低可诱导神经元凋亡[10]，而L-型钙通道激动剂Bay K8644可以阻断缺糖缺氧诱导的细胞凋亡[11]。由此可以推断，在慢性缺血过程中钙通道Cav1.3表达的减少也可能正是其导致迟发性神经元死亡的原因。这也正可以解释L-型钙通道拮抗剂在神经保护作用方面所引起的争议[12]。

L-钙通道Cav1.3虽近几年已被许多研究人员所关注，但对其在中枢神经系统所执行的具体功能还有待进一步的研究和探索。

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Effects of n-butylphthalide on expression of calcium channel Cav1.3 in ischemic cerebral cortex in rats

GUOSen，ZHUJiang，WANGYongwei，etal.

(DepartmentofHumanAnatomy，AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China)

Objective To investigate the effects of n-butylphthalide on expression of calcium channel Cav1.3 in ischemic cerebral cortex in rats. Methods 36 Male Wistar rats were divided randomly into three groups：a sham group，an ischemia group and a butylphthalide treating group. There were 12 rats in each group. Immunohistochemical staining and Western blotting were used to detect expression of calcium channel Cav1.3.Tunel was used to show the apoptosis in cerebral cortex. Results Compared with the rats in sham group，the expression of calcium channel Cav1.3 decreased obviously in the ischemia group and butylphthalide treating group. Compared with the rats in the ischemia group，the expression of calcium channel Cav1.3 increased obviously in the butylphthalide treating group. In butylphthalide treating group neural apoptosis were was less than in ischemia group，but more than in sham group. Conclusion The n-butylphthalide can restrain the decline of expression of calcium channel Cav1.3 in ischemia cerebral cortex，and reduce apoptosis of neurons.

N-butylphthalide； Ischemia； Cerebral cortex； L-type calcium channel； Rat

1003-2754(2016)01-0038-04

2015-11-10；

2015-12-29

河北省教育厅资助项目(No.QN20131075)

(1.承德医学院人体解剖学教研室，河北 承德 067000；2.承德医学院附属医院神经内科，河北 承德 067000)

郭 森，E-mail：guosen2004@126.com

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