鲜橘皮霉变部位主要微生物的检测研究

曹　丹，张爱梅，韩雪英，伏笑融

（西北师范大学生命科学学院，甘肃　兰州　730070）

鲜橘皮霉变部位主要微生物的检测研究

曹丹，张爱梅*，韩雪英，伏笑融

（西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州730070）

以新鲜橘子为材料，探究鲜橘皮霉变部位存在的主要微生物类型。通过形态学鉴定和生理生化检验等试验方法，初步判定鲜橘皮霉变部位存在的主要优势微生物包括3种细菌和3种霉菌。3种细菌分别是：枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌和环状芽孢杆菌；3种霉菌分别是：橘青霉、烟曲霉和炭黑曲霉。

鲜橘皮；细菌；真菌；分离；鉴定

橘子，俗称桔，是起源古老的多年生芸香科植物，华夏大地是其主要发源地之一。在中国，很久以前人们就开始食用橘子，并对其进行了人工栽培［1］。橘子酸甜可口，营养丰富，浑身是宝，尤其是橘皮，作用甚多。

橘皮，又名陈皮，新鲜橘皮含有大量的维生素C和香油精，具有理气化痰，健脾和胃的功能。利用橘子皮泡茶，味道清新还能通气提神；鲜橘皮还可以用来治疗咳嗽、便秘、睡觉磨牙、口臭、消化不良及胰腺炎等；另外，食品加工业利用鲜橘皮制橘皮粥、橘皮茶、橘皮酒、橘皮菜及橘皮果酱等，为其带来不少经济效益［2-3］。

近年来，对鲜橘皮的研究主要侧重于其药用价值，生物活性及化学反应等方面［4-6］，对鲜橘皮表面微生物的检测较少，而本研究侧重于鲜橘皮霉变部位主要优势微生物的分离纯化和鉴定。通过形态学鉴定和生化鉴定相结合的手段，对鲜橘皮霉变部位与正常部位的微生物进行比较，找出鲜橘皮霉变部位存在的主要优势微生物，并对以后橘皮表面微生物的研究提供一定的参考和依据。

一、材料与方法

（一）材料

原料：试验原料购自兰州市安宁区果蔬市场，为市售的同一品种的新鲜橘子。

（二）试剂、仪器与用具

1.试剂。草酸铵结晶紫、蕃红、碘液、95%乙醇、香柏油、二甲苯、孔雀绿、甲基红试剂、溴百里酚蓝、格里斯氏试剂、二苯胺试剂、吲哚试剂、对二甲基氨基苯甲醛、柠檬酸铁、柠檬酸钠、a-萘酚、氢氧化钾、乙醇、乙醚、二甲基氨基苯甲醛、1 mol/L盐酸、1 mol/LNaOH、过氧化氢等。

2.仪器。恒温水浴锅（KW-4）：上海必尔得仪器实业有限公司；智能型电热恒温培养箱（DHP-9080B）：上海琅玹实验设备有限公司；手提式压力蒸汽灭菌锅（DSX-280B）：上海申安医疗器械厂；封闭式调温加热器（MB-1-1）：北京科伟永兴仪器有限公司；超净工作台（DZ47LE-32 C32）：天津市拉贝尔实验室设备有限公司；显微成像系统（YYP一210）：日本NIKON公司；电子天平CP114（GB/T26497）：奥豪斯仪器（上海）有限公司制造；冰箱（BC-92）：广东奥马电器股份有限公司。

3.用具。刀片，接种环，载玻片，镊子，滤纸，牙签，酒精灯，玻璃棒，移液枪等。

（三）培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：用于细菌分离；察氏培养基：用于霉菌分离；生化鉴定采用休和利夫森二氏培养基、V_P实验培养基、硝酸盐还原实验培养基、丙酸盐培养基、柠檬酸盐实验培养基、吲哚实验培养基、葡萄糖氧化发酵培养基、明胶水解培养基、淀粉水解培养基等，按照《微生物学实验手册》［7］和《常见细菌系统鉴定手册》［8］配置。

（四）试验方法

1.鲜橘的处理。从市售鲜橘中挑选表面含有小霉点的橘子作为试验材料，将其置于恒温培养箱中，28℃的条件下放置36 h，待橘子表面霉变部位长大，呈现青灰色时即可进行后续步骤。

2.微生物的初步分离。无菌条件下，用灭菌剪刀在鲜橘皮霉变部位剪出1.5 cm×1.5 cm大小的面积，将剪下的橘皮用灭菌镊子夹至盛有50 mL无菌水的三角瓶中，封好瓶口并不断摇匀震荡，充分震荡20 min后，在三角瓶中取匀液1 mL，稀释至10-1、10-2、10-3、10-4的4个浓度梯度，用移液枪吸取1 mL稀释液到培养皿中，每一个稀释度上做出2组平行，及时将45℃的牛肉膏蛋白胨培养基和察氏培养基倾倒在平皿中，平板凝固后进行培养，28℃条件下培养48 h，观察菌落生长状况。在鲜橘皮正常部位采用同样的方法进行微生物的初步分离［9-10］。对正常部位与霉变部位微生物的生长状况进行对比。

3.微生物的纯化。培养48 h后，对于细菌：挑取形态不同的菌落于新的培养基中进行平板划线，当所生长的菌落大小、形态特征一致时，进行显微镜观察和革兰氏染色实验，确定微生物是否纯化。若未纯化，则继续挑取菌落，进行平板划线直至纯化。对于霉菌，用接种针挑取菌落边缘的菌丝，点种于培养基上并且记录菌落形态。若第一次纯化后培养物不纯，则进行第二次接种，直至菌落纯化好为止。

4.微生物的观察与鉴定

细菌：参考《微生物学实验手册》［7］《常见细菌系统鉴定手册》［8］、《伯杰细菌鉴定手册》［11］采取菌落观察、革兰氏染色、芽孢染色等方法初步鉴定；再通过接触酶、氧化酶、葡萄糖、糖醇发酵实验、V_P实验、吲哚实验、明胶水解、淀粉水解、柠檬酸盐实验、丙酸盐实验、硝酸盐还原、耐热性等进行生化鉴定。

霉菌：参考《微生物学实验手册》［7］《真菌的形态和分类》［12］首先进行形态观察和描述，其次用棉蓝染色镜检：在显微镜下观察霉菌的菌丝或孢子的形态和特征，孢子的排列等，并记录拍照。根据菌溶形态及镜检结果，确定菌种类型。

二、结果和分析

（一）鲜橘皮霉变部位与正常部位微生物生长状况比较

将霉变部位与正常部位分离到的微生物分别接种在牛肉膏蛋白胨培养基和察氏培养基上进行培养，待微生物生长出来后，比较其生长状况，结果如表1所示。

表1　霉变部位与正常部位微生物生长状况

观察并比较牛肉膏蛋白胨培养基和察氏培养基上的微生物生长状况发现：鲜橘皮霉变部位存在较多细菌和真菌，而正常部位几乎没有真菌，细菌较少。

（二）鲜橘皮霉变部位典型细菌的鉴定

观察细菌在牛肉膏蛋白胨培养基上的生长状况可发现，有些细菌大量存在于鲜橘皮霉变部位，而在橘皮正常部位几乎没有或很少。选取这些大量出现在霉变部位的典型细菌进行培养。通过观察，挑选出9株不同形态的菌株，反复划线分离，进行纯培养，并标记为：A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3。据初步鉴定，9株菌株可分为3类，A1、B2、C3为一类，记作NO1；A2、B1、C2为一类，记作NO2；A3、B3、C1为一类，记作NO3。NO1代表：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），NO2代表：短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus），NO3代表：环状芽孢杆菌（Bacillusbacillus）其菌落形态，革兰氏染色特征分别见图1和图2。

图1 细菌菌落形态

图2 革兰氏染色结果

由图1可知，NO1菌落形态呈圆形，0.7～0.8 μm×2.0～3.0 μm，边缘齿状，表面隆起黏稠，乳白色，不透明；NO2存在半透明型和不透明型两种不同的菌落形态，图中所示为不透明菌落，经过三次纯化后半透明型菌落逐渐消失。NO2菌落形状不规则，0.6～0.7 μm×2.0～3.0 μm，边缘不整齐，表面粗糙，乳白色，不透明。NO3菌落呈圆形，1.0～1.5 μm×2.0～7.0 μm，边缘整齐，表面无皱褶，隆起，乳白色，不透明。

图2是在40×的显微镜下观察到的。由图2可知，菌株均是革兰氏阳性菌，NO1呈杆状，链状，产芽孢，中生或偏端生，椭圆或柱形，孢囊不膨大；NO2呈杆状，链状，产芽孢，偏端生，椭圆形或柱形，孢囊不显著膨大；NO3呈杆状，链状，产芽孢，中生或极生，孢囊稍膨大。

由图1与图2的结论初步进行判断：NO1、NO2、NO3都属于芽孢杆菌属。为进一步进行菌种鉴定，做细菌的生理生化检验，结果如表2所示：

表2　生理生化鉴定结果

菌株NO1能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麦芽糖等。吲哚实验为阴性，接触酶试验、硝酸盐还原实验、柠檬酸盐实验、淀粉水解及明胶水解均为阳性，V-P测定为阳性，丙酸盐利用为阴性，5℃、55℃条件下不生长，在7%、10%的高盐环境中生长良好，因此可以判断：以菌株NO1为代表的一类细菌为枯草芽孢杆菌。

菌株NO2能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麦芽糖等，但不能利用乳糖。接触酶试验、柠檬酸盐实验、明胶水解均为阳性，硝酸盐还原实验、淀粉水解及丙酸盐利用为阴性，V-P测定为阳性，5℃、55℃条件下不能生长，在7%盐环境中生长良好，因此可以判断：以菌株NO2为代表的一类细菌为短小芽孢杆菌。

菌株NO3能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麦芽糖等，但不能利用乳糖。接触酶试验、硝酸盐还原实验、柠檬酸盐实验、明胶水解、淀粉水解均为阳性，V-P测定为阴性，5℃、55℃条件下不能生长，在7%盐环境中生长良好，10%盐环境中不能生长，因此可以判断：以菌株NO2为代表的一类细菌为环状芽孢杆菌。

（三）鲜橘皮霉变部位几种主要真菌的鉴定

对鲜橘皮霉变部位分离到的真菌进行纯化培养，观察真菌在察氏培养基上的生长状况，发现主要有3类真菌大量出现，对它们依次标号为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。其菌落形态特征如图3所示，与菌落相应的显微形态特征如图4所示。

图3 真菌菌落形态图

图4 真菌显微形态图（40×）

通过观察可以初步判断：真菌Ⅰ菌丝淡色，有横隔，分生孢子梗顶端有扫帚状分支，分支为多极的分生孢子梗，分生孢子呈球形，属于青霉属。真菌Ⅱ、Ⅲ匍匐于基质上的菌丝向空中伸出球形或椭圆形顶囊的分生孢子梗，在其顶端的小梗或进一步分枝的次级小梗上生出链状的分生孢子，属于曲霉属。

真菌在培养基上继续生长，由幼态逐渐走向成熟，观察它们的变化趋势并对其进行进一步判断。

真菌Ⅰ菌落具有放射状皱纹，有同心环，质地通常绒状；反面为橙黄色，可溶性色素为黄色；菌丝体白色，有大量淡黄色渗出液，分生孢子梗生于基质；帚状枝双轮生，或三轮生，同轮中长短不一，分生孢子呈球形或近球形；总体来看，该菌株很可能为：青霉属中的橘青霉。

真菌Ⅱ菌落在培养基上生长迅速，中心稍凸，质地丝绒状兼有少量絮状；分生孢子结构较少，浅灰绿色，老后颜色加深，反面黄褐色；渗出液无色；分生孢子头呈短柱状；分生孢子梗生于基质；顶囊烧瓶形，产孢结构单层；分生孢子近球形，壁粗糙。该菌株应该为：曲霉属中的烟曲霉群。

真菌Ⅲ菌落在培养基上生长迅速，菌落平坦，质地丝绒状；分生孢子结构大量，孢子头黑色，反面淡黄色且中部呈现黑褐色；无渗出液；分生孢子头幼时球形，老后分裂成柱状结构；分生孢子梗生于基质；顶囊球形，产孢结构双层；分生孢子球形，壁粗糙。该菌株应该为：曲霉属中的炭黑曲霉。

三、结论

本试验对鲜橘皮表面的微生物进行分离纯化，比较鲜橘皮霉变部位和正常部位微生物的生长状况，通过形态学鉴定和生理生化检验相结合的方式，发现了存在于鲜橘皮霉变部位的几种主要的优势微生物。其中有9株典型的细菌最终鉴定为3类：以NO1为代表的枯草芽孢杆菌，以NO2为代表的短小芽孢杆菌，以NO3为代表的环状芽孢杆菌；另外还检测到了来自于青霉属和曲霉属的3种真菌，分别是：橘青霉、烟曲霉及炭黑曲霉。

本试验的结论，对于鲜橘皮霉变部位微生物的检测提供了一定的参考依据，如果对于霉变部位的优势微生物进行针对性的杀菌抑制，或许可以对鲜橘皮的霉变起到一定的阻碍作用。随着社会的发展，消费者对健康的要求越来越高，因此，在橘皮食品加工方面很有必要考虑使用干净无霉变的新鲜橘皮作为加工原料，满足广大消费者的需要，从而获取更好的经济效益。

［1］傅维康.橘子史话［J］.上海中医药杂志，2008，（11）：69-70.

［2］一个橘子等于五味药［J］.科学大观园，2015，（11）：13.

［3］杨璞.桌边床前放点橘子皮有利睡眠［J］.家庭医药，2014，（9）：79.

［4］张茂信.橘皮煎汤外洗治足癣［J］.浙江中医杂志，2001，（7）：40.

［5］杨艳，罗爱民，潘雪雪，金晶.橘皮中功能成分的提取及其应用研究［J］.湖北民族学院学报（自然科学版），2013，（3）：292-296.

［6］范琼，张学亮，张弦，冯思苗.橘子皮对水中亚甲蓝的吸附性能研究［J］.中国生物工程杂志，2007，（5）：85-89.

［7］周德庆.微生物学实验手册［M］.上海：上海科学技术出版社，1986.

［8］东秀珠，蔡妙英.常见细菌鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001.

［9］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/f4789.22010食品卫生微生物学检验菌落总数测定［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［10］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/r4789.152010食品卫生微生物学检验霉菌和酵母菌计数［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［11］布坎南，吉本斯.伯杰细菌鉴定手册［M］.北京：科学出版社，1984.

［12］戴芳澜.真菌的形态和分类［M］.北京：科学出版社，1987.

（编辑：张琼琼）

S379.5

B

1673-9019（2016）17-0029-03

2016-05-26

曹丹（1994-），女，甘肃会宁人，主要从事微生物研究。

张爱梅（1973-），女，甘肃武威人，副教授，主要从事微生物生态学的研究。