盘式固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法快速测定环境水样中3种微囊藻毒素

赵彬，张敏，张付海，田丙正，王鑫

（安徽省环境监测中心站，合肥 230071）

盘式固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法快速测定环境水样中3种微囊藻毒素

赵彬，张敏，张付海，田丙正，王鑫

（安徽省环境监测中心站，合肥 230071）

建立盘式固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS-MS）快速测定环境水样中3种微囊藻毒素（MCs）的方法。环境水样经过盘式固相萃取柱净化，采用Waters BEH C18色谱小柱，以乙腈-0.2%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱分离后，UPLC-MS-MS多级监测正离子模式下外标法进行定性定量分析。3种微囊藻毒素在0.05～10.0 µg/L范围内呈现良好线性关系，相关系数均大于0.999 4，方法检出限为0.02 ng/L。对同一环境样品进行0.1，1.0，5.0 µg/L 3种浓度的加标回收试验，平均回收率为82.8%～108.8%，测定结果的相对标准偏差为2.1%～10.1%（n=6）。该方法快速、灵敏、准确，可有效应用于环境水样中微囊藻毒素的监测。

盘式固相萃取柱；超高效液相色谱-串联质谱法；环境水样；微囊藻毒素

微囊藻毒素（MCs）是蓝藻死亡过程中释放的一种水溶性肝毒素和神经毒素，目前已经有80多种不同结构的MCs得到鉴定，其中存在最为普遍、含量相对较多的是MC-LR，MC-RR，MC-YR［1-2］。近年来世界上淡水湖泊蓝藻爆发频率增加，巢湖做为我国第五大淡水湖，每年蓝藻不时爆发。为了更好地监测微囊藻毒素对巢湖地区生态环境的影响，建立这类物质的快速、灵敏和准确的监测方法尤为重要。

目前测定微囊藻毒素的方法主要有生物化学法［3-4］、酶联免疫检测法［5］、高效液相色谱法［6-8］和液相色谱-质谱联用法［9-11］等。生物化学法选择性较差，灵敏度不够，只能测定毒素总量，无法分别测定不同种类毒素的含量。酶联免疫法假阳性出现几率大，且重现性差。液相色谱法则因环境水样基质复杂、背景干扰多等因素而不易用于定性，容易出现假阳性。液相色谱-质谱串联法检测能更好地应对基质复杂、存在背景干扰的样品监测要求。环境水样品的前处理方法主要液-液萃取、加速溶剂萃取（ASE）、固相小柱萃取（SPE）等。目前选择盘式固相萃取方法对环境水样进行处理鲜有报道。

笔者比较了直接进样、固相小柱萃取和盘式固相萃取法3种方法，最终建立了盘式固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱快速测定环境水样中3种微囊藻毒素的方法。该方法检出限低，快速、灵敏、准确，可有效应用于环境水样的实际监测。

1　实验部分

1.1主要仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪：Waters TQ-S型，美国Waters公司；

Masslynx4.1工作站：美国Waters公司；

膜盘萃取仪：Sepaths-6型，美国LabTech公司；

盘式固相萃取膜盘：C18，Φ47 mm，美国Waters公司；

固相萃取柱：C18，Φ47 mm，美国Waters公司；

定量平行浓缩仪：MultiVap-8型，北京莱伯泰科公司；

超纯水制备仪：Millipore Milli-Q Integral15型，美国Millipore公司；

有机滤头：0.22 µm，美国Waters公司；

MC-LR，MC-RR ，MC-YR标准物质：纯度不小于99.9%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

二氯甲烷、甲醇、乙腈：农残级，美国Merk公司；

无水硫酸镁：优级纯，中国国药集团；

实验室用水为Milli-Q纯水系统制备的超纯水。

1.2样品的采集与保存

采集河流水样储存于5 L棕色玻璃采样瓶中，用甲酸调至pH小于2，加入0.01～0.02 g抗坏血酸除去残余氯，于4℃冷藏保存，24 h内分析。

1.3样品前处理

盘式固相萃取：静置水样30 min以上，使其自然沉降。然后取上层水样500 mL于萃取瓶中，加入0.5 mL甲酸，用盘式固相萃取膜盘萃取。

膜盘萃取条件：用10 mL甲醇润洗，10 mL超纯水平衡5 min，水样流量约为50 mL/min，用10 mL甲醇-水（体积比为1∶10）净化，抽至近干后，用15 mL甲醇-0.2%甲酸溶液（体积比为9∶1）洗脱。加入0.5 g无水硫酸镁除水。洗脱液用浓缩氮吹仪于40℃下以乙腈-0.2%甲酸溶液（体积比为1∶4）分多次转换溶剂定容至1 mL。用0.22 µm有机滤头过滤，待测。

1.4仪器工作条件

1.4.1超高效液相色谱条件

色谱柱：Waters BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 µm，美国Waters公司）；流动相：A为乙腈，B为水-0.2%甲酸溶液，采用线性梯度洗脱，洗脱条件见表1；流动相流量：0.4 mL/min；样品温度：10℃；色谱柱温：40℃；检测器：串联四级杆质谱仪；进样体积：5 µL。

表1　液相色谱线性梯度洗脱条件

1.4.2质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI）正离子模式进行检测，监测模式为多级反应监测模式（MRM）；喷射电压：1.5 kV；源温度：150℃；脱溶剂气温度：450℃，流量为800 L/h；锥孔气流量：150 L/h；锥孔电压和碰撞能见表2。

表2　MRM分析条件

2　结果与讨论

2.1样品前处理条件的优化

2.1.1样品净化方法的选择

目前环境水样的前处理方式多采用液-液萃取、超声萃取、固相小柱萃取等方法。

直接进样可以避免样品前处理过程带来的目标物损失，但是不能应对复杂基质干扰；液-液萃取和超声萃取操作繁琐，基质复杂的环境样品难以有效除去杂质，且会消耗大量有机试剂，对环境造成二次污染；加速溶剂萃取不能用于含水量过高的样品；固相小柱萃取（SPE）大体积水样操作时间过长且易发生小柱过载；而盘式固相萃取法具有固相小柱萃取净化效果好的优点，能够快速萃取大体积水样，消耗有机试剂少，操作自动化程度高，简单易操作。因此选取盘式固相萃取柱法为样品的前处理方法。

2.1.2洗脱液及其用量的选择

影响固相萃取效果的主要因素有洗脱剂类型及其用量等。对于极性样品，甲醇、乙腈等亲水性有机溶剂作为常用洗脱剂被广泛应用。对不同洗脱剂进行试验，结果表明，用甲醇-0.2%甲酸溶液洗脱效果最佳。在甲醇中添加不同浓度的甲酸溶液（0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%）进行试验，结果表明，MC-RR和MC-LR的回收率明显改善，但随着甲酸浓度的增加MC-YR的回收率有所下降，原因可能是加入甲酸后，微囊藻毒素在酸性环境下多肽质子化，同时也减少了其和硅胶表面硅醇基之间的相互作用，使其更容易被洗脱。最终选择甲醇-0.2%甲酸溶液（体积比为9∶1）为洗脱液。

2.2色谱及质谱条件的优化

2.2.1色谱条件的优化

分别比较不同类型的反相色谱柱（Waters BEH C18，Waters HSS T3，Waters HSS C8）对待测物质的色谱分离效果。结果表明，MC-RR，MC-YR和MC-LR在Waters BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 µm）上获得了理想的分离效果。

甲醇和乙腈是液相色谱常用的流动相。考察了甲醇-水和乙腈-水流动相体系对目标物离子化程度的影响，发现乙腈-水为流动相时，仪器响应值高于甲醇-水流动相。由于目标物的基本结构是7个氨基酸组成的单环多肽，在正离子电离模式下溶液中能够电离出H+，所以在流动相中适当加入酸性物质可以促进目标物的电离，从而获得较高的离子化效率。选择0.2%甲酸溶液作为流动相进行试验，并获得了最佳结果。选择梯度洗脱方式，优化流动相梯度洗脱条件，在5 min内实现了目标化合物的快速分离测定。

2.2.2质谱条件的优化

根据微囊藻毒素具有多肽质子化的化学电离性质，选用正电离模式（ESI+），采用蠕动泵直接进样进行质谱条件优化。根据CAC和EU第657/2002 /EEC号决议有关规定，选择两对离子监测MRM。通过仪器自带软件Masslynx4.1的自动优化软件IntelliStart，对目标物的锥孔电压、碰撞能、定量离子和辅助定性离子进行了优化和确定。MC-LR，MC-YR和MC-RR的MRM色谱图见图1。

2.3标准曲线、线性范围及检出限

将标准储备液用流动相稀释成6种不同浓度的系列标准溶液（0.05，0.1，0.5，1，5，10 µg/L），按实验方法测定。以标准溶液的质量浓度为横坐标，对应色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程及相关系数。根据HJ 168-2010方法检出限计算公式MDL=t（n-1，0.99）S，重复空白试验7次，计算得各组分的检出限，结果见表3。

图1　MC-RR、MC-YR和MC-LR的MRM色谱图

表3　线性方程及检出限

2.4回收试验与精密度

对一实际环境水样品（未检出目标物）进行添加回收试验，样品分别添加低、中、高（0.1，1.0，5.0 µg/L）3个浓度的标准溶液，每个添加浓度平行测定6次，并计算其相对标准偏差。回收试验及精密度试验结果见表4。由表4可知，该方法具有较高的准确度和良好的精密度。

表4　种目标物的相对标准偏差和回收率（n=6）

3　结语

建立了盘式固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱联用技术同时快速测定环境水体中3种微囊藻毒素（MC-LR，MC-YR，MC-RR）的方法。环境水样经盘式固相萃取，超高效液相色谱分离，串联质谱（UPLC-MS/MS）正离子多级离子监测（MRM）模式检测，外标法定量。结果表明，该方法快速、灵敏、准确，操作简单且具有较高的准确度和精密度，可以作为环境水样中衡量微囊藻毒素的监测方法。

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色谱和波谱自动连接技术“破解”中药化学成分密码

中药及天然药物化学成分与生物活性的研究是阐明中药治疗疾病的科学内涵及实现中药现代化的前提和基础。而天然药物中活性成分分离是研究中的一大难关，工作量大、针对性差、重复率高等问题，使得活性成分分离效率难以提高。

中国药科大学副校长孔令义带领的团队，经过20年的努力，创建了系列色谱和波谱技术自动连接制备分离和结构识别一体化的中药和天然药物化学成分分离新技术，发现了生物活性化合物和结构新颖的化合物。新技术的应用加快了中药物质基础研究与开发的步伐，推动了中药的现代化和国际化，该项研究获2015年国家科技进步二等奖。

1 探究中药化学成分分离新技术

样品损失、分离效率低是天然药物化学成分研究中的拦路虎。20世纪80年代，美国学者研发的一项高速逆流色谱技术，以其无固体支撑、根据物质在两相中分配系数的差异对物质进行分离，避免了传统色谱技术因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。

孔令义带领团队深入开展了高速逆流色谱在制备分离各类中药活性成分中的适用性研究，创造性地将制备型色谱分离技术（HSCCC，HPLC，MPLC）和波谱测定技术（MS）连接，建立了色谱和波谱技术自动连接制备分离和结构识别一体化的中药及天然药物化学成分分离系列新技术，显著提升了天然活性化合物和结构新颖化合物的发现和分离水平。

2 基于新技术的中药成分研究

多年来，孔令义带领课题组应用新技术，从60余种中药及天然药物中分离鉴定了5 000余个化合物，发现了600余个新化合物，其中新骨架化合物25个。同时，建立了中药和天然药物化合物库，在中药和天然药物的研究和开发中发挥了重要作用。此外，该项目对化合物的生物活性开展了系统研究，阐明了部分中药和药用植物临床治疗疾病的物质基础，确定了具有降血糖、抗过敏性哮喘、抗肿瘤等显著活性的化合物42个，并为开发具有自主知识产权的新药奠定了基础，其中2个化合物被列为国家科技重大专项重大新药创制候选药物。

课题组将分离新技术应用到中药化学对照品的研究制备中，取得了很好的效果。将分离制备的中药化学对照品应用于《中国药典》2010年版的质量控制研究中，起草了12个中药及饮片的质量标准，并已颁布实施，保证了相关中药临床应用的安全性和有效性。

（ 中国分析计量网）

珠海投资3 000万改造市场食品检测室

珠海市在不久前召开全市食品安全工作会议暨创建食品安全城市动员会上公布了《珠海市食品安全城市创建试点工作实施方案》，要求到2018年5月，全市各区达到广东省食品安全城市考核评价标准的各项要求，成为“广东省食品安全城市”；2019年年底通过国家食品安全考核验收，成为“国家食品安全城市”。

会上，珠海市副市长龙广艳代表市政府与各行政区签订了食品安全责任书。食品安全责任书明确了创建食品安全城市的“七个工程”，分别是国家食品安全横琴创新工程、小作坊集中加工区建设工程、食用农产品批发农贸市场升级改造工程、餐厨垃圾无害化资源化工程、四小行业经营规范工程、食品安全监管科技工程和监管队伍素质提升工程。

其中，农贸市场升级改造这一工程珠海老百姓并不陌生，珠海市政府2015年已投入6 000多万元，已建成11家新农贸市场，完成83家旧农贸市场的改造升级，今后3年，珠海市还将继续投入3 000多万元，对全市94家农贸市场的食品检测室进行提升和完善。

（仪器信息网）

Rapid Determination of Three Kinds of Microcystin Algae Toxins in Environmental Water Sample by Disk SPE-Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Zhao Bin， Zhang Min， Zhang Fuhai， Tian Bingzheng， Wang Xin
（Anhui Provincial Environmental Monitoring Center Station， Hefei 230071， China）

A rapid determination of three kinds of microcystin algae toxins（MCs） in environmental water samples method by using disk SPE-ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS-MS） was established. Environmental water samples was extracted by disc solid-phase extraction column（C18）， three kinds of MCs was separated by Waters BEH C18chromatographic column with acetonitrile-0.2% formic acid solution as mobile phase，gradient elution separation， UPLC-MS-MS multi-stage monitoring mode （MRM） under the external standard method was used for quantitative analysis. Three kinds of MCs in the range of 0.05-10.0 µg/L showed good linear relation， the correlation coefficient were more than 0.999 4， the method detection limit was 0.02 ng/L. Under 0.1， 1.0， 5.0 µg/L standard addition for the same environmental samples， the average recovery was 82.8%-108.8%. The relative standard deviation of determination results was 2.1%-10.1%（n=6）. This method is rapid， sensitive and accurate， it can be effectively applied monitoring of algal toxins in environmental water samples.

disc solid-phase extraction column； ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； environmental water sample； microcystin algae toxins

O657.7

A

1008-6145（2016）02-0048-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.02.014

联系人：张敏；E-mail： zhaobin19831102@163.com

2015-12-18