表征天然抗氧化剂活性的方法

王 会

(河南应用技术职业学院药学与检验系，河南 郑州 450042)



表征天然抗氧化剂活性的方法

王 会

(河南应用技术职业学院药学与检验系，河南 郑州 450042)

抗氧化剂能使含有油脂或脂肪的食品保质期延长，保持其营养质量和风味；对人体内因过氧自由基引起的氧化损伤有调节作用，对人类的健康有益。因此，从蔬菜、水果、草药等植物中寻找天然抗氧化剂并对其活性加以表征成为研究的热点。本文在脂质氧化机理的基础上讨论了抗氧化剂的作用机理，并以此为依据总结、概括了四类用于表征天然植物抗氧化剂活性的方法。

抗氧化剂；抗氧化活性；表征方法

氧化在人体和食品中的重要性已被普遍认可。氧化代谢是细胞生存的本质，其副作用是生成自由基和活性氧。过量的自由基破坏细胞，导致细胞呼吸作用中断；活性氧造成人体的氧化损伤。这些反应能加速老化，在癌症、心脏病等疾病中起重要作用。氧化是食品变质的主要原因之一，氧化造成食品酸败，导致营养品质、色泽、风味、质构和安全的降低。

近年来，植物来源的食品和饮料(如水果、茶、红葡萄酒等)及草药等对人类健康的有益影响引起人们的广泛关注，主要是因为其所含有的天然抗氧化剂。因此，从植物中筛选出具有活性的物质并加以表征成为研究的热点。

抗氧化剂能修复过氧自由基对人体的损伤，延长含脂食品的保质期及营养质量，因此测量、表征抗氧化剂活性的方法就分为在人体内和在食品体系中两类。本文只讨论在食品中测定和表征抗氧化剂的方法。

1 抗氧化剂的作用机理

脂质氧化是造成食品变质的主要原因之一。脂质的氧化主要是自动氧化，自动氧化是一个自由基链反应，其反应过程如下[1]：

引发：

传播：

终止：

LH是被氧化的含有不饱和键的脂质底物，H是双键旁亚甲基上最活泼的氢原子，M为过渡金属离子，X·为未知自由基。

抗氧化剂AH与脂质自由基L·反应，延缓或抑制自由基链反应的引发(发生)；与脂质过氧自由基LOO·或脂质自由基LO·反应，抑制链反应的传播：

抗氧化剂自由基A·也可与与LOO·或LO·反应，生成LOOA、LOA，从而进一步阻止链传播反应的进行：

此外，AH也可与M3+作用，阻止链的引发。

因此，抗氧化剂的活性的表征主要从以下几个方面进行：

2 表征抗氧化剂的方法

2.1 抑制脂质过氧化的方法

该法是建议使用的最佳表征方法。脂质氧化涉及到反应物、氧化的中间产物和终产物。通过添加被测物质，氧化过程中反应物、中间产物和终产物出现的时间长短或数量减少，表明被测物具有抗氧化活性。

氧化反应的底物一般常使用纯的甘三酯、植物油、鱼油或猪油，也有使用磷脂或脂蛋白、海产油、多不饱和脂肪酸(如亚油酸)作为底物的[2]。氧化反应的底物在使用过程中常被制成(水)胶束和反胶束体系或用有机溶剂溶解。这些常用的底物大多是混合物，且不同实验中选用的底物往往不同，因此实验结果的重现性一般较差。另外，有些含有VE等抗氧化剂的植物油因自身所含有的抗氧化活性成分也可能会干扰测定。因此，进行抗氧化活性表征时应根据具体的测试方法选择合适的反应物和测试体系。

在常温条件下，食品中脂质氧化反应的发生进行得很慢；在测定抗氧化剂活性时，因为抗氧化剂的添加，使得脂质氧化反应的进行变得更慢[2]。因此，在表征抗氧化活性时，常要加速氧化反应的进行，比较常用的加速氧化的方法有升温或增加氧浓度，如烘箱法、活性氧法、Rancimat法、OSI法。但是，人为加速脂质氧化反应的进行与食品自动氧化变质的反应条件不同，而且高温可能改变氧化反应机理，用加速氧化的方法表征的抗氧化活性有可能导致错误的结果[2]。近年来也常用自由基引发剂加速脂质氧化反应，最常用的是具有热不稳定性的偶氮化合物，其中水溶性的AAPH和脂溶性的AMVN用得最多[2]。但偶氮化合物加速脂质氧化反应时，抗氧化剂的活性主要体现在其供氢快慢上。而且有些抗氧化剂除其自身有活性外，其被氧化后的产物也具有抑制自由基的作用，在表征抗氧化活性时如果不考虑这一点，也可能导致错误的结果。此外，加速氧化的方法还有使用Fe3+或Cu2+等过渡金属离子、光照(如紫外光)。但是光照引起脂质氧化的机理与上述的氧化机理不同，因此这种方法不常用[2]。

测定脂质氧化过程中反应物、中间产物或终产物的量的变化的方法很多[2]，主要有：

(1)化学法：过氧化值、碘值、酸值、TBARS法、羰基化合物、克雷斯试验和茴香胺值；

(2)物理法：粘度、颜色、共轭二烯含量、折光指数、介电常数的测定；红外光谱法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱和质谱联用；测不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率(C18:2/C16:0)、聚合物的含量、极性脂类的含量；测量体系中氧的减少造成压力变化的氧压法、测量氧消耗的氧电极法、测量底物中不饱和脂肪酸的减少以及氧化后底物的增重等方法。

在这些方法中，以过氧化值、共轭二烯含量、TBARS法和气相色谱法最为常用。各种方法都有优缺点，实际测定中将各种方法结合使用。

2.2 清除人工生成的自由基的方法

用人工合成的自由基替代脂质氧化生成的自由基来测定抗氧化剂的活性也是目前广泛采用的方法。根据被测物清除自由基能力的强弱，确定其抗氧化活性的高低。常用的人工合成的自由基有[2-4]：

(1)ABTS+·：ABTS [2, 2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt]在K2S2O8、MnO2、ABAP或H2O2等氧化剂作用下生成的蓝绿色的自由基阳离子，相当稳定，在414、645、734和805nm处有最大吸收峰；

(2)DMPD+·：DMPD(N, N-dimethyl-p-phenylenediamine) 在酸性条件下被ABAP、FeCl3、CuCl2或H2O2等氧化，生成的稳定的自由基阳离子，它在505nm处有最大吸收峰；

(3)DPPH· (2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl)是一种稳定的自由基，其乙醇溶液显紫色，在515 nm处有最大吸收；

(4)Fremy自由基(potassium nitrosodisulphonate，五硫化二钾)；

(5)galvinoxyl自由基量[2,6-di-tert-butyl-a-(3,5-di-tert-butyl-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-ylidene)-p-tolyloxy]。

在抗氧化剂的作用下，ABTS+·、DMPD+·和DPPH·的浓度降低，吸光度减小，吸光度的减少可用分光光度计测定；而Fremy自由基和galvinoxyl自由基浓度的降低可用电子自旋共振-ESR仪测定。根据吸光度的变化和自由基浓度的变化就可测定抗氧化剂的活性。在这几种自由基中，ABTS+·和DPPH·使用最广。

人工合成的自由基的最大不足之处在于其稳定，存在的时间长。生物体或食品中的自由基存在的时间短，大多存在几秒甚至是不足1 s，而人工合成的自由基往往存在几小时甚至是几天或更久，用它们代替因氧化而生成的自由基，与抗氧化剂实际抗氧化活性起作用的环境不同，所以在实验中测得的具有抗氧化活性的抗氧化剂，在真实的食品或生物体系中有无活性，还需要做具体实验加以验证。

2.3 测定抗氧化剂还原能力的方法

金属离子是氧化的催化剂，抗氧化剂能螯合金属，分解过氧化物，从而在氧化发生前中止自由基引发的氧化。因此，抗氧化剂抗氧化活性的高低还可以通过其还原能力的强弱来表示。常用的测定方法有[5]：

(1)FRAP(ferric ion reducing antioxidant power，铁离子还原抗氧化能力)法；

(2)CUPRAC法(Copper Reduction Assay,铜还原法)；

(3)FC(Folin-Ciocalteu，福林酚)法；

(4)CV(Cyclic Voltammetry，循环伏安)法；

FRAP法是在酸性介质中抗氧化剂将Fe3+-TPTZ (2,4,6-tripyridyltriazine，2,4,6-三吡啶三嗪)络合物还原成深蓝色的Fe2+-TPTZ，其在593 nm吸光度增加，表明其抗氧化活性的强弱。但此法测得的只是还原Fe3+的能力，不一定反映抗氧化活性，且不能测量含有巯基的抗氧化剂如谷胱甘肽。

CUPRAC法用Cu而不是用Fe，抗氧化剂将Cu2+还原为Cu+。Cu+与显色剂结合，生成在某一波长处有最大吸收的物质。显色剂有两种，在Bioxytech AOP-490法中，显色试剂bathocuproine (2,9-dimethyl-4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline)与Cu+形成在490 nm处有最大吸收的络合物；另一种显色剂neocuproine (2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline)与Cu+的络合物在450 nm有吸收。对于抗氧化测定，铜优于铁，且铜反应比铁快。

CV法的原理如下：样品放入装有工作电极(玻璃化碳电极)、参比电极(Ag/AgCl)和辅助电极(铂线)的测试皿中。测定时，记录电压电流曲线(即循环伏安图)。样品的还原能力由峰电位和阳极电流两个参数组成。峰电位由被测物的氧化还原性质决定，电流值表示这种化合物的数量。CV法是一种很有前途的方法，测得的是复杂混合物的总抗氧化能力。CV法不可逆，敏感度低，但是结果可靠，重复性好，适于比较研究。

2.4 抗氧化剂抑制自由基对底物的氧化降解的方法

此类方法的测试体系中既有底物又有自由基，但底物自身不能生成自由基，它与外源自由基反应，形成有荧光或带颜色的特征物质，抗氧化剂的加入使生成的特征产物减少，荧光或吸光度减小，由此可测得抗氧化活性。此类方法也可以称为竞争法，主要有[5]：

(1)ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity，氧自由基吸收能力)法；

(2)TRAP(Total Radical Trapping Antioxidant Parameter，总自由基清除抗氧化参数)法；

(3)DCFH-DA(dichorofluorescin-diacetane，二氯荧光素二乙酸酯)法；

(4)化学发光(chemiluminescence, CL)法；

(5)β-胡萝卜素漂白法(β-carotene bleaching test)；

(6)藏花素漂白法(crocin bleaching test)；

(7)KI法；

(8)TOSC(Total Oxyradical Scavenging Capacity，总氧自由基清除能力)法。

此类方法中最为常用的是ORAC法，此法测得的是总的抗氧化活性，可自动化、标准化。TRAP法与ORAC法类似，它也是采用藻红蛋白(PE)为底物，不同之处在于动力学曲线以及由动力学曲线计算出的抗氧化活性。TRAP法中PE荧光的减弱与时间呈线性关系(以恒定的速率减弱)，直到荧光减弱80%；而ORAC法中荧光强度的减小随时间减慢(不以恒定的速率进行)。其他的几种方法用得比较少，只在少数表征抗氧化活性的研究中使用。

3 结 语

在实际研究中，表征某种物质是否具有抗氧化活性，一般选择两种或两种以上的方法。通过上述方法证明某物质具有抗氧化活性，在真实的食品体系中该物质不一定有活性或者其活性不一定很强，往往需要多方面加以表征。开发通用性好、重现性好，与真实食品体系相似的实验体系是筛选和研究植物来源抗氧化剂的趋势。

[1] 毕艳兰. 油脂化学[M].北京:化学工业出版社, 2005:62-63.

[2] 王会，郭立，谢磊. 抗氧化剂抗氧化活性的测定方法(一)[J].食品与发酵工业，2006，32(3)：92-98.

[3] 王会，周燕. 筛选和表征抗氧化剂的方法-ABTS法[J].广州化工，2012，40(22)：41-43.

[4] 王会. 筛选和评价天然抗氧化剂的方法-DPPH法[J].广州化工，2013，41(22)：30-32.

[5] 王会，郭立，谢磊. 抗氧化剂抗氧化活性的测定方法(二)[J].食品与发酵工业，2006，32(4)：98-102.

Methods of Evalution of Natural Antioxidant Activity

WANGHui

(Department of Pharmaceutical and Laboratory, Henan Vocational College of Applied Technology,Henan Zhenghou 450042, China)

Antioxidants can prolong the shelf life of foods containing oil or fat, and maintain their nutritional quality and flavor. Antioxidants can also regulate the oxidative damage induced by free radicals of human body, which is beneficial to human health. So it is a hot research topic to search for natural antioxidants from vegetables, fruits, herbs and other plants. The mechanism of lipid oxidation and the mechanism of the oxidation resistance action of antioxidants were discussed. Based on the mechanisms, four kinds of methods used to characterize the antioxidant activity of natural plants were reviewed.

antioxidant; antioxidant activity; evaluating methods

王会(1970-)，女，副教授，主要从事化工及相关专业的教学及科研。

TS227

A

1001-9677(2016)020-0030-03