四通道荧光成像观察胶质母细胞瘤的血管起源

梅鑫 张清平 陈建良 陈银生 张洁 陈芙蓉 陈忠平* (中山大学肿瘤防治中心神经外科，广东 广州 50060; 深圳市福田区人民医院神经外科，广东 深圳 580; 苏州大学第一附属医院神经外科，江苏 苏州 5000)

四通道荧光成像观察胶质母细胞瘤的血管起源

梅鑫1张清平2陈建良2陈银生1张洁3陈芙蓉1陈忠平1*
(1中山大学肿瘤防治中心神经外科，广东 广州 510060;2深圳市福田区人民医院神经外科，广东 深圳 518033;3苏州大学第一附属医院神经外科，江苏 苏州 215000)

目的胶质瘤的血管起源于宿主还是肿瘤本身一直存在争议。我们先前的研究发现胶质瘤干细胞有向内皮细胞分化的能力。方法本研究我们将胶质瘤干细胞用荧光蛋白标记后，移植于荧光鼠皮下成瘤，再采用荧光标记肿瘤血管内皮细胞(CD34)，通过四通道荧光显像观察移植瘤的血管。结果我们在胶质瘤干细胞GSC-1建立稳定表达红色荧光蛋白的RFP-GSC-1细胞系。在绿色荧光裸鼠移植成瘤后，对移植瘤标本的四通道荧光成像结果显示：移植瘤的大部分血管来源于宿主，但在其中一个移植瘤中发现有移植肿瘤细胞来源的血管内皮细胞，位于肿瘤中央区域。结论本研究结果提示，移植瘤的血管主要是宿主来源细胞为主的管道，同时也存在肿瘤细胞来源的管道。

胶质母细胞瘤; 荧光裸鼠; 免疫荧光

近年研究发现胶质瘤血管新生方式不仅仅有传统观念认为的宿主血管来源的芽生和套叠[1]。胶质母细胞瘤中存在一种新的血管生成模式，即拟态管道发生[2]。对于这种不表达或者低表达内皮细胞标记物的管道上构成管壁细胞的来源研究很少。有学者认为是具有多项分化能力的肿瘤干细胞向内皮细胞分化形成[3]，也有学者认为是肿瘤转移过程中滞留在血管壁上的一个短暂的现象[4]。也有认为其来源于宿主骨髓造血干细胞[5]，骨髓间充质干细胞[6]。为了能够阐明拟态管道上的管壁细胞的来源，我们需要建立一个观察模型来显现管道形成的过程。

研究发现特定条件下进行三维培养的胶质瘤细胞(RFP-GSC-1)能逐渐形成管道样结构，同时细胞表面的分子标记物也在变化，逐渐表达内皮细胞标记物[7]。体外的胶质瘤细胞是在特定条件下向内皮细胞分化，对于体内环境中的胶质瘤细胞如何在肿瘤形成早期获得血供我们还不是很清楚。我们将体外研究使用的RFP-GSC-1细胞进一步用于裸鼠移植瘤模型，来探寻体内胶质瘤微循环模式的构筑。

裸鼠移植瘤模型能很好的模拟肿瘤发生时的体内环境，准确反映宿主和肿瘤之间的相互影响下管道形成的模式。由于需要同时观察肿瘤细胞、裸鼠自身内皮细胞和肿瘤细胞表面分子标记物，我们建立了四通道荧光成像观察荧光鼠移植瘤模型，观察肿瘤血管新生模式，从而分析拟态管道管壁细胞的来源。

材料与方法

一、主要试剂和设备

表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)(Sigma, 美国)、成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)(Sigma, 美国)、B27(Invitrogen, 美国)、DMEM/F12(Gbico, 美国)、Triton-X100 (中衫金桥, 中国)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(中衫金桥, 中国)、Alexa fluor@647(Abcam, 美国)、抗淬灭剂(Abcam, 美国)、一抗均来自美国Abcam公司。5只4 w龄Foxn1nu/b6-cag-egfp/su品系鼠，为苏州大学附属第二医院黄强等[8]建立的出生后全身组织细胞带有绿色荧光的无胸腺免疫裸鼠(许可证号码：SYXK(苏)2012-0045)由苏州大学实验动物中心提供。按spf(specific pathogen free animals)标准饲养。流式细胞仪(Beckman-Coulter, 美国)、慢病毒(GeneChem, 中国)。

二、建立RFP-GSC-1细胞系

复苏之前本实验室建立的GSC-1细胞系[7]并控制其处于对数生长期，向细胞悬液中加入5 μl Polybrene以及2 ml的病毒培养上清，混匀，悬浮培养于添加0.04 ng/ml EGF、1 μl/ml bFGF、0.02 ml/ml B27的DMEM/F12干细胞培养液中。感染6 h后加入2 ml新鲜培养基，待感染细胞增长至80%以上密度后，进行嘌呤霉素压力筛选。筛选3 d后检验阳性细胞纯度。

三、检验RFP-GSC-1细胞纯度

GSC-1和新建立的RFP-GSC-1细胞传代培养于37℃、5%CO2培养箱中，悬浮培养于添加0.04 ng/ml EGF、1 μl/ml bFGF、0.02 ml/ml B27的DMEM/F12干细胞培养液中。选取对数生长期的RFP-GSC-1细胞和对照组GSC-1细胞，消化、离心，收集细胞于离心管中，磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline, PBS)漂洗3遍，并转移至流式上样管中备上机。细胞终浓度为1～2×106个/ml。细胞采用Beckman-Coulter公司CXP anlysis进行流式细胞(Flow Cytometry, FCM)分析。

四、裸鼠皮下荷瘤模型

收集处于对数期生长的RFP-GSC-1细胞，调整为密度1×106/ml的单细胞悬液悬于不含血清的DMEM培养基中，取200 μl细胞悬液接种于裸鼠背侧肩胛部皮下。待肿瘤直径2～3 mm时取瘤，中性福尔马林固定后石蜡包埋，按5 μm厚度切片。

五、CD34免疫荧光染色

移植瘤标本石蜡切片常规脱蜡水化后，3%的双氧水去除内源性过氧化物酶的影响， PBS洗3次×5 min，柠檬酸盐缓冲液(0.01 mol/L, pH: 6.0)微波修复，室温冷却后PBS洗3次×5 min，山羊血清封闭20 min，滴加稀释好的CD34(1 ∶1 000)，4℃湿盒内过夜，复温30 min后PBS洗3次×5分钟，Alexa Fluor@647孵育40 min后，PBS洗3次×5 min，现配4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染核3 min，PBS洗3次×5 min，抗淬灭剂封片。

结 果

一、RFP-GSC-1细胞系和绿色荧光鼠移植瘤模型的建立

建立的RFP-GSC-1细胞系(图1 A, 白色箭头)在培养过程中稳定表达RFP(红色荧光蛋白)。RFP-GSC-1细胞系纯度达到98.8%(图2B)，而对照组(未转入RFP慢病毒的GSC-1细胞系)几乎不表达红色荧光(图2A)。在荧光鼠移植瘤模型中可以观察到在瘤体内部较少见到裸鼠的组织细胞，大部分以肿瘤细胞为主(图1B)。在瘤体周边可以观察到较多的裸鼠组织细胞(图1C)。

二、四通道荧光成像观察荧光鼠RFP-GSC-1移植瘤微循环构筑

本次应用四通道荧光成像主要有：①405波长通道，为蓝色，显示DAPI染色的细胞核形态(图3A)；②488波长通道，为绿色，显示表达GFP的裸鼠细胞(图3B)；③594波长通道，为红色，显示表达RFP的肿瘤细胞(图3C)；④645波长通道，为黄色，显示表达CD34的细胞(图3D)。在观察的5个标本中有1个标本中发现肿瘤来源的管道，其余四个标本都是以宿主来源管道为主。①通过微循环构筑模型的四通道荧光成像发现以荧光鼠细胞来源为主的微循环管道。其中裸鼠来源的GFP细胞分布在肿瘤周边，而RFP细胞少量的散落在局限的区域(图3E)，此外增加CD34标记物标记有内皮功能的细胞呈现黄色荧光(图3D)。散在的大量供血管道中GFP细胞分布广泛(图3F, 白色箭头)，而RFP细胞则分布较局限(图3E)。大量GFP细胞表达CD34(图3F, 白色箭头)，也有部分RFP细胞表达CD34(图3G, 白色箭头)。②通过微循环构筑模型的四通道荧光成像观察发现以肿瘤细胞来源为主的微循环管道(图4)。其中裸鼠来源的细胞带有GFP呈现绿色荧光(图4B)，而肿瘤细胞带有RFP呈现红色荧光(图4C)。此外增加CD34标记物标记有内皮功能的细胞呈现黄色荧光(图4D)。在肿瘤区域普遍表达RFP，而中心血供处有散在表达GFP的裸鼠来源的细胞(图4E, 白色箭头)。GFP细胞构成其中一段微循环CD34+管道(图4F, 白色箭头)而RFP细胞在其周围形成了许多环绕的CD34+管道结构(图4G, 白色箭头)。

图1 RFP-GSC-1裸鼠移植瘤模型观察

Fig 1 Observation of RFP-GSC-1 cells xenograft mouse model

A: RFP-GSC-1 cells expressed RFP; B: In the central area of tumor tissue, there were mainly RFP-GSC-1 cells (red); C: In the marginal area of tumor tissue, there were mainly mouse somatic cells (green).

Scale bar= 50μm.

图2 RFP-GSC-1细胞纯度检验

Fig 2 Purity of RFP-GSC-1 cells

A: GSC-1 of detection control group hardly expressed RFP; B: The purity of RFP-GSC-1 was 98.8%.

图3 荧光鼠细胞来源为主的微循环管道

Fig 3 Microcirculation channels mainly formed by fluorescent mouse cells

A: DAPI stained for uncles, blue; B: Mouse somatic cells expressed GFP, green; C: Tumor cells expressed RFP, red; D: Endothelial cells expressed CD34, orange; E: In the marginal area of tumor tissue, there were mainly mouse somatic cells (white arrows); F: Mouse derived vessels expressed GFP and CD34 (white arrows); G: Tumor cells derived vessels expressed RFP and CD34 (white arrows); H: In the marginal area of tumor tissue, there were mainly mouse derived vessels after merged.

Scale bar 50 μm.

图4 肿瘤细胞来源为主的微循环管道

Fig 4 Microcirculation channels mainly formed by tumor cells

A: DAPI stained for uncles, blue; B: Mouse somatic cells expressed GFP, green; C: Tumor cells expressed RFP, red; D: Endothelial cells expressed CD34, orange; E: In the central area of tumor tissue, there were mainly tumor cells (white arrows); F: Mouse derived vessels expressed GFP and CD34 (white arrows); G: Tumor cells derived vessels expressed RFP and CD34 (white arrows); H: In the central area of tumor tissue, there were mainly tumor cells derived vessels after merged.

Scale bar 50 μm.

讨 论

本次研究建立了RFP-GSC-1细胞系和荧光鼠移植瘤模型。RFP-GSC-1细胞系是之前研究得到的胶质瘤干细胞系GSC-1[7]基础上加入稳定表达红色荧光蛋白基因而得到。在活细胞荧光成像中有独到的示踪作用，弥补其它各种染色示踪办法只能针对固定处理后的失活细胞的不足。同时，RFP-GSC-1细胞系拓展了传统活细胞成像的观察范围[9]，不仅从形态方面进行记录，还可以实时监测细胞表面分子标记物的变化。近年新兴的体内肿瘤细胞示踪技术可以直观的观察肿瘤生长、侵袭和转移[10]。我们同样建立了RFP-GSC-1荧光鼠移植瘤模型，为之后体内肿瘤生物学特性动态观察奠定基础。RFP-GSC-1荧光鼠移植瘤模型可以有效区别移植瘤和裸鼠来源的细胞，排除肿瘤标记物的相对特异性的局限，满足四通道荧光观察的条件。

在传统免疫荧光双染方法中，CD34+细胞中部分具有明显核异型性的细胞来源不明。因此很难客观的阐述宿主来源的血管和肿瘤细胞形成的管道之间关系。RFP-GSC-1荧光鼠移植瘤模型更加精确的反映胶质瘤中微循环的构筑，加之CD34免疫荧光染色，能充分展示肿瘤中管道的位置以及管壁细胞的来源。我们本研究结果显示，在肿瘤的边缘部分主要是裸鼠来源的血管提供肿瘤营养。而在肿瘤内部可以观察到以肿瘤细胞为主构成的管道。CD34+管道的管壁细胞有肿瘤来源的细胞和裸鼠来源的细胞共同构成。

多通道荧光成像技术[11]可以更细致的描述细胞分子水平的状态和变化。之前的荧光成像研究通常是双荧光[12]、甚至三荧光染色[13]。本次研究应用了四通道荧光成像技术来展示肿瘤细胞的生长及分子表型变化，首次结合荧光鼠和荧光肿瘤加之免疫荧光染色，有效的区别肿瘤来源细胞、裸鼠来源细胞，探索肿瘤生长过程中分子表型变化，排除裸鼠来源细胞在观察中的影响。此外RFP-GSC-1荧光鼠移植瘤模型配合多通道荧光成像技术为活体荧光成像[14]提供基础，结合新型的体内荧光探针显像技术[15]在未来可以在活体内观察肿瘤分子表型，为脑胶质瘤精准治疗提供可行的动物实验模型。

我们本研究在五个移植瘤中发现一个具有移植瘤细胞来源的血管形成，提示，移植瘤的血管主要是宿主来源细胞为主的管道，但同时也存在肿瘤细胞来源的管道，尤其是在肿瘤中央区域。其机制尚不完全明了，但推测可能是肿瘤中央区域由于缺氧等因素诱导肿瘤细胞向内皮细胞分化，形成管道，起到微循环的补偿作用。

致谢：感谢苏州大学附属第二医院黄强教授等提供Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU小鼠及相关技术指导。

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Identificationoftheglioblastomavascularorigincellthroughfour-channelimmunofluorescentimaging

MEIXin1,ZHANGQingping2,CHENJianliang2,CHENYinsheng1,ZHANGJie3,CHENFurong1,CHENZhongping1

1DepartmentofNeurosurgery,SunYat-senUniversityCancerCenter,Guangzhou510060;2DepartmentofNeurosurgery,FourthPeople'sHospitalofShenzhen,Shenzheng518000;3DepartmentofNeurosurgery,FirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Soochow215000, China

ObjectiveThere was a controversy of whether the blood vascular in glioma initiating from host or tumor cell. Our previous study demonstrates that endothelial differentiation capacity of glioma stem cells (GSC-1 cells). The study aims to probe deeply into the origin of the blood vascular in glioma.MethodsGSC-1 cells were labeled by red fluorescent protein (RFP-GSC-1) and transplanted into green fluorescent mouse. The 5 xenograft samples were stained by CD34 (endothelial marker) immunofluorescence (IF) and were observed under four channels immunofluorescence imaging microscope.ResultsThe RFP-GSC-1 cells were established and expressed RFP stably. The xenograft samples were scanned under four channels immunofluorescence imaging microscope. The result showed that the host-derived vessels were the main blood supply system of xenograft tissue. However, one of five samples contained tumor-derived vessels in the central region of xenograft tissue.ConclusionThis study reveals that the majority of blood supply vessels are the host-derived but tumor cell is also an origin of blood vessels in glioma.

Glioblastoma; Fluorescent mouse; Immunofluorescence

1671-2897(2016)15-221-05

·论著·

R 739.41

A

国家自然科学基金资助项目(81372685)；国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2015CB755505)；广东省自然科学基金资助项目(S2013040012894)；广东省科技计划项目资助项目(2013B021800067)；深圳市科技计划项目资助项目(JCYJ20140416094330210)

梅鑫，博士研究生，E-mail: meixin@sysucc.org.cn

*通讯作者： 陈忠平，教授、主任医师，E-mail:chenzp@sysucc.org.cn

2016-01-01；

2016-03-30)