体外研究人脐带血间充质干细胞对大鼠枯否细胞极化的影响

李 亮，彭 琼，蔡亦红，戴 夫



体外研究人脐带血间充质干细胞对大鼠枯否细胞极化的影响

李 亮1，彭 琼1，蔡亦红2，戴 夫1

目的 采用脂多糖(LPS)诱导大鼠枯否细胞(KCs)发生极化改变，之后用人脐带血间充质干细胞(huMSCs)与LPS诱导的KCs在Transwell内共培养,以观察huMSCs对KCs极化偏移的调节作用。方法 实验分为KCs组、KCs+LPS组、KCs+LPS+MSCs组。对各组的白介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-10(IL-10)、白介素-6(IL-6)等上清因子采用ELISA法进行检测；诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg-1)、信号传导与转录激活因子3、6(STAT-3、STAT-6)、核因子kappaB(NF-κB)用Western bolt进行检测，同时用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)对以上结果进行验证。结果 KCs+LPS组促炎因子TNF-α、IL-6分泌增加，KCs+LPS+MSCs组抑炎因子IL-10、IL-4分泌增加；而Western blot检测表明，KCs+LPS组中iNOS升高，NF-κB p65入核增高；而KCs+LPS+MSCs组高表达Arg-1，同时pSTAT-3、pSTAT-6表达增加。结论 huMSCs能诱导已经发生M1极化的KCs向M2表型偏移，考虑可能与huMSCs分泌细胞因子有关，起到一种免疫调节作用，huMSCs调节巨噬细胞极化的分子机制可能与通过JAK-STAT信号转导通路有关。

枯否细胞；人间充质干细胞；免疫调节；极化

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)取材方便，易于体外培养增殖，除了多向分化能力，还具有独特免疫特性，因此MSCs移植有希望成为很多疾病治疗的有效手段。越来越多的研究者认为MSCs分泌的细胞因子和免疫调节对肝脏损伤起主要作用[1]。另外MSCs分泌的细胞因子也具有强大的调节作用。近年来MSCs对巨噬细胞的免疫调节作用的研究也成为热点。巨噬细胞参与对抗病原体的第一道防线，各组织的巨噬细胞具有相对特异性，肝脏的巨噬细胞称为KCs，占肝脏非实质细胞的0.35，占生物体所有实质脏器的巨噬细胞总数的0.8～0.9[2]，对各种肝脏疾病的发病与转归起重要作用。成熟巨噬细胞在不同的微环境中可被诱导分化出不同的表型和功能状态，称为巨噬细胞的极化。目前很多研究[3-5]已经证实MSCs能促进巨噬细胞向M2方向极化，所以研究巨噬细胞极化机制对治疗各种肝病具有重要意义。目前人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，huMSCs)和大鼠KCs体外共培养尚无报道，该实验首先提取大鼠原代KCs，并观察huMSCs在体外对大鼠KCs偏移极化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞 普通级健康雄性SD大鼠20只，8～10周龄，(200±20) g，购于苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司，室温下自由进食标准颗粒饲料、卫生饮水，实验前12 h禁食，6 h前禁水。huMSCs为合肥市滨湖医院干细胞中心刘尚全教授馈赠。

1.2 主要试剂和仪器 青霉素、链霉素、胰酶细胞消化液和谷氨酰胺(上海碧云天生物技术研究公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；Percoll细胞分离液、台盼蓝(美国Sigma公司)；APC-CD68抗体(美国eBioscience公司)；HEPA Class l00二氧化碳培养箱(美国Termo electron corporation)；TSl00倒置显微镜(日本Nikon公司)；IX51 荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；AllegraX-30R梯度离心机(美国Beckman Coulter公司)；6孔细胞培养板和Transwell(美国Corning公司)；PCR试剂盒(美国AXYGEN公司)；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (加拿大Fermentas公司)；PCR Master Mix和二抗 tetramethylrhodamine goat-anti-rabbit IgG(美国Promega公司)；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa公司)；TRIzol(美国Invitrogen公司)；一抗anti-iNOS和anti-STAT6(美国BD Transduction Laboratories公司)；anti-Arg 1、anti-NF-κB p65(美国Santa Cruz公司)，免疫荧光一抗NF-κB p65抗体(英国Abcam公司)；核蛋白提取试剂盒NucBuster Protein Extraction Kit(德国Novagen公司)；磷酸化酶/蛋白酶抑制剂 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (美国Cell Signaling公司)。

1.3 大鼠原代KCs的提取及鉴定 SD大鼠吸入乙醚麻醉，酒精消毒，放于无菌托盘，打开腹部和胸腔至见到肝、肺、心脏等器官，结扎下腔静脉，行门静脉插管，以15 ml/min速度灌注PBS液10 min，0.5 mg/ml浓度的IV型胶原酶20 ml原位灌注10 min，取肝脏并剪碎至1 mm小块。0.5 mg/ml IV型胶原酶30 ml震荡消化(37 ℃)。用细胞滤网(200目)滤过，去除未消化的肝脏组织。肝脏细胞悬液300 r/min离心5 min(4 ℃)，离心2次，弃上清液除去残留消化酶，再次1 550 r/min离心5 min(4 ℃)，取沉渣重悬，0.30和0.60 percoll密度梯度1 850 r/min离心20 min(20 ℃)；取出乳白色细胞层，利用KCs贴壁特性进一步纯化，纯化后细胞以2×106/孔铺板，进一步用于后续实验。台盼蓝染色实验：细胞提取后，立即以10 μl细胞悬液和90 μl 0.4%台盼蓝充分混匀，2～3 min后，取10 μl至计数板，台盼蓝染色实验后显微镜下观察计数。吞墨实验：用培养24 h后的细胞加入经过滤纸多次过滤并高压灭菌过的墨汁，6 h后显微镜下观察细胞的吞噬能力。可见细胞内充满大小不一的黑色颗粒，但细胞仍然存活。

1.4 流式细胞术检测细胞表面标志物 收集KCs，调整细胞浓度为(1～2)×106/ml，取50 μl细胞悬液，加入2 μl FITC-CD68，低速振荡5 s、混匀，室温下避光孵育20 min后，加适量PBS洗1次，上流式细胞仪进行检测。

1.5 huMSCs与 KCs在 Transwell内共培养 将KCs细胞以1×106/ml铺到Transwell(0.4 μm孔径)的下层，并加入终浓度为1 μg/ml的LPS，培养18 h后，将huMSCs以1×105/孔铺到Transwell板的上层，将二者共培养18 h，同时设置正常培养的KCs组及加入LPS诱导的KCs组以及KCs+LPS+MSCs组。huMSCs和KCs共培养时，KCs+LPS组同时加等量DMEM作对照，分别收集各组培养18 h上清液、18 h KCs细胞蛋白、RNA以便进行后续实验。

1.6 ELISA试剂盒检测上清液相关细胞因子 收集各组上清液，用ELISA试剂盒分别检测IL-6、IL-10、IL-4、TNF-α细胞因子的水平。采用终浓度为1 μg/ml的LPS与KCs共培养18 h，再与等量DMEM或者huMSCs 共培养18 h后检测各组IL-4、IL-6、IL-10细胞因子水平。而TNF-α为Transwell内与huMSCs共培养18 h后，再以终浓度为1 μg/ml的LPS诱导6 h后再检测。

1.7 Western blot检测iNOS、Arg-1、STAT3、p-STAT3、STAT6、p-STAT6、NF-κB p65蛋白表达 实验各组KCs中加入磷酸化酶/蛋白酶抑制剂，加入裂解缓冲液提取总蛋白，并按试剂盒说明提取核蛋白。将提取蛋白按100 μg/孔加样，置于SDS-PAGE凝胶上电泳分离，在硝酸纤维素膜上进行转膜、电转、TBST清洗硝酸纤维素膜3次后移至含有封闭液的平皿中，稀释一抗(1 ∶500)后孵育2 h，后进行二抗孵育(1 ∶1 000)，最后化学发光，显影，定影，将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统(Image J)分析目标带的分子量和净光密度值。用全蛋白裂解液检测目的蛋白表达，用GAPDH为内参照；用核蛋白裂解液检测细胞核内NF-κB p65水平，用Histone为内参照。

1.8 荧光实时定量PCR分析M1/M2相关基因转录水平 收集各组的KCs细胞总RNA用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA,设计引物，用SYBR Green PCR mix试剂盒分别检测IL-10、IL-6、iNOS、Arg-1 mRNA水平，引物见表1。

表1 荧光实时定量PCR所用引物序列

2 结果

2.1 SD大鼠KCs鉴定 刚提取的KCs成圆形或者椭圆形，透光性好，大小均匀，可见微量杂细胞。台盼蓝染色后经细胞计数，细胞活力为(0.931 1±0.009)(n=3)。培养48 h后可见细胞贴壁，变得形状不规则，部分细胞呈梭形。培养1周后可见大部分细胞形态更加不规则，贴壁牢固，透光性较前略差。台盼蓝染色实验、吞墨实验以及流式细胞术鉴定细胞活力及纯度，经检测活力及纯度均大于0.92，可用于下一步实验，结果见图1。

2.2 各组培养上清液中细胞因子的表达 KCs+LPS组中的KCs经LPS刺激后，促炎因子TNF-α分泌增加，KCs+LPS+MSCs组中的IL-10、IL-4分泌增加。说明KCs+LPS+MSCs组中的KCs高分泌抗炎因子IL-4和IL-10，结果见图2。

2.3 各组蛋白表达情况 KCs+LPS组高表达iNOS，而KCs+LPS+MSCs组高表达Arg-1，KCs+LPS+MSCs组可诱导STAT3/STAT6磷酸化；而KCs+LPS组可诱导NF-κB p65磷酸化，促进其核转位，见图3。通过收集KCs+LPS+MSCs组及KCs+LPS组细胞24 h后的细胞全蛋白裂解液，经Western blot检测，以正常细胞为阴性对照。实验结果表明，KCs+LPS+MSCs组高表达Arg-1，低表达iNOS；而KCs+LPS组高表达iNOS，低表达Arg-1，见图3。

图1 SD大鼠KCs的鉴定

A：新提取原代细胞培养6 h KCs×100；B：KCs台盼蓝染色图×100；C：原代培养48 h KCs×200；D： KCs吞墨实验；E：未经CD68染色的正常细胞作为空白对照组；F：CD68流式抗体染色，经流式细胞仪检测，分析细胞的纯度大于92%(n=3)

图2 各组上清液中细胞因子水平 (n=3)

图3 各组相关细胞因子表达量A：各组收集全细胞裂解液用相应的抗体进行蛋白印迹实验；用灰度测定法定量分析蛋白印迹结果并进行比较；B：实验各组收集细胞全蛋白裂解液(检测NF-κB p65、NF-κB p-p65)；各组收集细胞核蛋白裂解液(NF-κB p65)；用灰度测定法定量分析核内蛋白印迹NF-κB p-p65结果；C：收集细胞核蛋白裂解液(检测NF-κB p65)；1：KCs组；2：KCs+LPS+MSCs组；3：KCs+LPS组；与KCs组比较： **P<0.01；与KCs+LPS组比较：##P<0.01

2.4 各组iNOS、Arg-1、IL-10、IL-6 mRNA水平 通过荧光实时定量PCR对以上结果中iNOS、Arg-1、IL-10、IL-6 mRNA表达水平进行验证，结果显示，KCs+LPS+MSCs组高表达Arg-1、IL-10 mRNA，而KCs+LPS组高表达iNOS mRNA。KCs+LPS组与KCs+LPS+MSCs组IL-6 mRNA水平差异无统计学意义，见图4。

2.5 huMSCs促进大鼠KCs向M2方向转化 当用LPS诱导KCs时，KCs高表达TNF-α，并且Westein blot检测结果显示iNOS高表达，提示KCs经LPS诱导后可以成功向M1表型转化。在此基础上，用huMSCs与极化的KCs共培养，KCs+LPS+MSCs组高表达Arg-1，并且上清液细胞因子IL-10、IL-4浓度明显增加，提示KCs向M2方向极化。以上结果经荧光实时定量PCR鉴定，提示KCs表型发生改变。为进一步研究表型转化机制，从胞质蛋白中提取STAT-3、STAT-6、pSTAT-3、pSTAT-6以及在核内和核外提取NF-κB p65。结果显示，在静息状态时，NF-κB p65蛋白主要是位于细胞质内，LPS能刺激NF-κB p65核转位增加，但与huMSCs共培养时发现其入核减弱，而NF-κB p-p65入核增多，弱化了炎性基因表达，提示其参与了KCs的表型转化。因此，可以得知MSCs通过分泌细胞因子调节KCs表型转化。

图4 各组同一时间点收集细胞后提取RNA，应用实时定量PCR分析相关基因的mRNA水平

1：KCs组；2：KCs+LPS组；3： KCs+LPS+MSCs组；与KCs组比较：**P<0.01；与KCs+LPS组比较：#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

有研究者利用人骨髓MSCs治疗猪的爆发性肝衰竭[6]，所以利用不同种系的细胞共培养具有可行性。当肝脏发生急性炎症变化时，MSCs条件培养基能改变白细胞浸润，通过分泌营养因子减少肝细胞凋亡，增加肝细胞的增殖，进一步发挥对炎症部位进行修复作用。MSCs可以引起调节性T细胞的增加并减少树突细胞分泌TNF-α，Th1细胞分泌IFN-α和Th-2细胞分泌IL-4[7]。不论外源性或者内源性MSCs对巨噬细胞的极化起到明显调节作用。目前，根据巨噬细胞的功能和表型分为经典活化的M1型极化和选择性活化的M2型极化，经典激活途径的巨噬细胞通常可以由LPS、干扰素α、肿瘤坏死因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子诱导M1方向极化，主要参与体内炎症反应，有促炎作用，能高分泌IL-1、IL-6、TNF-α，具有高IL-12、IL-23、低IL-10表型。而旁路激活途径的巨噬细胞具有清除寄生虫，促进组织修复，促进血管形成及肿瘤发展的作用。具有高IL-10、低IL-12、IL-23表型，高水平清道夫受体，CD206并高表达Arg-1[8]，类似于T细胞亚群Th1和Th2亚群在炎症中的变化。众所周知，LPS能诱导巨噬细胞向经典的M1型巨噬细胞偏移，但是近年巨噬细胞极化后在乙型病毒性感染所致的肝纤维化中发挥重要作用[9]。M2型巨噬细胞在酒精性肝病中促进肝细胞衰老[10]，所以采用huMSCs对LPS已经诱导M1型巨噬细胞进行干预来研究KCs的偏移极化。

本实验在Transwell内共培养huMSCs和KCs两种细胞，用huMSCs和经LPS诱导后的KCs共培养证明实验组IL-10、IL-4分泌增加，体外研究表明MSCs能够通过分泌IL-10、IL-4部分促进巨噬细胞激活途径改变，并发现MSCs分泌前列腺素E2与前列腺素E2受体亚型EP4作用后可以增加巨噬细胞IL-10的分泌，荧光实时定量PCR验证结果提示KCs分泌细胞抗炎因子IL-4、IL-10增加。本实验中ELISA检测提示IL-6在实验组升高，而M2表型的枯否细胞多为IL-6分泌减少，近年来发现MSCs也存在不同表型[11]，因此，MSCs不同表型是否对巨噬细胞极化有影响值得进一步研究。从上清液TNF-α以及iNOS表达增加看，经LPS诱导后部分细胞已经发生M1极化，再与huMSCs细胞共培养后，经本实验验证，提示可以进一步发生M2极化偏移，这可能反映从炎症到修复的一个过程，巨噬细胞M1和M2极化代表了一个广泛的、连续的巨噬细胞功能状态[12]，与不同表型的巨噬细胞在不同炎症阶段发挥不同作用相符。但也有研究[13]表明M2极化的巨噬细胞能促进M1细胞凋亡，调节肝脏炎症反应。这说明不同表型的巨噬细胞来源及作用和调节机制需要进一步证实和验证。

目前肝脏疾病中巨噬细胞的个体发生情况仍不清楚，巨噬细胞发生极化的分子机制很复杂，包括多种信号通路参与其中，激活NF-κB和STAT1主要促进M1巨噬细胞极化，而STAT3和STAT6激活促进巨噬细胞M2极化进一步发挥其免疫功能[14]。其中NF-κB信号蛋白的激活对于M1型巨噬细胞偏移极化非常重要。NF-κB家族含有5个成员：p50、p52、p65(RELA)、RELB和REL蛋白，这些蛋白二聚化可引发NF-κB的入核增加，促进炎症因子表达，同时也参与细胞的生存和凋亡过程。NF-κB检测结果提示经LPS诱导后，激活M1型巨噬细胞并产生相关炎症介质如TNF-α升高，iNOS表达增加。在试验中当LPS刺激后，NF-κB p65入核增多，但与huMSCs共培养时发现其入核减弱，提示其参与了KCs的表型转化。体外实验已经明确提示MSCs能诱导巨噬细胞发生M2极化，本研究结果显示KCs+LPS+MSCs组pSTAT-3、pSTAT-6蛋白合成增加，提示其信号转导途径与JAK-STAT信号通路有关。STAT-6是IL-4介导的信号通路主要效应蛋白分子[15]，这与本实验中IL-4升高是一致的，IL-4的升高通过各种途径进一步促进核内基因表达，介导M2细胞分化成熟[16]。M2型巨噬细胞可以通过Arg-1水解精氨酸，产生鸟氨酸，鸟氨酸是脯氨酸和多肽前体，与纤维化疾病相关。

总的来说，本实验证明了huMSCs分泌的可溶性因子诱导大鼠KCs向M2表型的转化，这一过程通过调节巨噬细胞JAK-STAT信号通路实现。但是，由于巨噬细胞极化的分子机制相当复杂，需要进一步实验验证。目前明确的是MSCs分泌的细胞因子及免疫调节作用是明确的，对进一步研究huMSCs应用于终末期肝病的治疗有明确的意义，同时也说明了MSCs细胞治疗具有独特的免疫优势，可以用于多种疾病的免疫治疗。

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Li Liang1，Peng Qiong1，Cai Yihong2，et al

[1DeptofGastroenterology,TheThirdAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity(TheFirstPeople’sHospitalofHefei),Hefei230001；2SchoolofPublicHealth,AnhuiMedicalUniversity，Hefei230032]

The effect of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells on the polarization of rat Kupffer cellsinvitro

ObjectiveLPS-stimulatedKupffercells(KCs)andhumanumbilicalcordbloodmesenchymalstemcells(huMSCs)wereco-culturedinTranswelltoobservetheeffectofhuMSCsonthepolarizationofKCs.MethodsDuringthisstudy,themodelofhuMSCsin vitroco-culturingwithKCswasbuilt,andthreegroupswereassigned,whichwereKCsgroup(normalgroup)，KCscells+LPSgroup(controlgroup),KCs+LPS+MSCsgroup(experimentalgroup).Amongthethreegroups,IL-4,TNF-α,IL-10,IL-6weredetectedbyELISAwhileinduciblenitricoxidesynthase(iNOS),arginase-1(Arg-1),phosphorylationreactionlevelofsignaltransducerandactivatoroftranscription-3,6(STAT-3,STAT-6)andnuclearfactor-κB(NF-κB)weredetectedbyWesternbolt.Afterthat,qRT-PCTwasadoptedtocheckthepreviousresults.ResultsItwasfoundthatbothTNF-αandIL-6secretionincreasedinthecontrolgroup,whilebothIL-10andIL-4secretionincreasedintheexperimentalgroup.WesternblotdetectionshowedthatthelevelofiNOSincreasedinthecontrolgroup,NF-κBp65increasedinthenucleus,whiletheexperimentalgroupwashighexpressionofArg-1,pSTAT-6,pSTAT-3.ConclusionOurexperiment’sfindingsindicatethathuMSCscaninducealternativeactivationofKCs,andtheactivationpathwaymightbetheJAK-STATpathways.

mesenchymalstemcells；Kupffercells；polarization；signalingpathway

时间：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.020.html

国家自然科学基金(编号：81101272)

1安徽医科大学第三附属医院(合肥市第一人民医院)消化内科， 合肥 230001

2安徽医科大学公共卫生学院， 合肥 230032

李 亮，男，硕士研究生；

戴 夫，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：hfsdf@sina.com

R 318.06

A

1000-1492(2016)01-0041-06

2015-10-12接收