Ad-BMP-2/BMSCs/DBM对兔股骨头坏死修复的实验研究

石正松,李 强,宁寅宽,蔡伟良,李诗鹏



Ad-BMP-2/BMSCs/DBM对兔股骨头坏死修复的实验研究

石正松,李 强,宁寅宽,蔡伟良,李诗鹏

目的 应用聚合酶链式反应(RT-PCR)、电镜扫描(SEM)和X射线能谱分析技术(EDS)评价腺病毒-骨形态发生蛋白-2/骨髓间充质干细胞/脱钙松质骨(Ad-BMP-2/BMSCs/DBM)对兔股骨头坏死的治疗效果，为临床治疗股骨头坏死探索新途径。方法 ① 采用髓芯减压联合液氮冰冻法制备兔股骨头坏死模型；② 将造模成功的兔子随机均等分为A、B、C、D组(n=12)，A组不植入材料，为造模组，B、C、D分别植入DBM、DBM/BMSCs、BMP-2/BMSCs/DBM；③ 术后4、8、12 周各组分别处死4只兔子，运用RT-PCR、SEM、EDS检测股骨头BMP-2表达量、表面形貌和钙磷比(Ca/P)，观察股骨头的修复情况。结果 RT-PCR结果显示各时间点BMP-2表达量A组

股骨头坏死；骨髓间充质干细胞；骨形态发生蛋白2；RT-PCR；电镜扫描；能谱分析

股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)确切病因不明，目前公认的致病因素有13种[1]，是在不同病因下股骨头血液供应障碍,引起软骨下骨变性、坏死,继而造成股骨头塌陷,最终引发髋关节退行性、破坏性改变的一种疾病。有文献[2]表明ONFH已经替代了髋关节结核，跃居髋关节疾病首位[3]，并且ONFH有了年轻化趋势。目前对于ONFH的治疗方法有多种，例如中医疗法、体外微波冲击治疗、髓芯减压[4]、髋关节置换等[5]，但是这些均不是理想而合理的治疗方法，探寻更为有效的治疗手段势在必行。骨组织工程的发展在治疗ONFH方面展现了良好的前景，并逐渐成为研究热点。种子细胞、支架材料、细胞调控因子是骨组织工程学的3个基本要素。但是究竟采用何种种子细胞最好，选取哪种支架材料为宜，如何解决细胞调控因子持续表达的问题，国内外尚无定论[6]。该实验通过腺病毒介导人骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein，BMP-2)转染骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)复合脱钙松质骨(demineralized bone matrix，DBM)的方式构建组织工程骨,将其植入兔ONFH模型,旨在探讨其对ONFH的修复能力,为将来骨组织工程的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 组织工程骨(hBMP-2/BMSCs/DBM) 本课题组经过前期研究，已利用腺病毒介导hBMP-2转染BMSCs复合DBM的方式成功构建了组织工程骨[7]。

1.1.2 实验动物 新西兰大白兔48只，雌雄不拘，约3.2 kg，清洁级，购于桂林医学院实验动物中心，对动物的处理符合伦理学精神。

1.1.3 主要试剂和器材 水合氯醛(天津大茂化学试剂厂)；凝胶海绵(江西祥恩医疗科技发展有限公司)；注射用青霉素钠(华北制药公司)；总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；M-MLV First Strand Kit试剂盒(上海沪峰生物科技有限公司)；DNA Marker(北京天根生化科技有限公司)；2×Taq Mastermix(大连宝生物工程有限公司)；多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)；场发射扫描电镜(荷兰Philips公司)；X射线能谱分析仪(英国Oxford公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模 实验动物均右侧参与实验，参照李海冰 等[8]髓芯减压术联合液氮冰冻的操作步骤，实验动物取俯卧位，10%水合氯醛水溶液耳缘静脉注射(3 ml/kg)麻醉。由臀大肌与阔筋膜张肌的间隙进入，暴露臀小肌及髓关节外旋肌群，并贴骨面将其切断，暴露关节囊以后小十字口切开，外旋股骨头，使股骨头暴露而不使其脱位，在骨与软骨的交界处用直径为3.5 mm的无菌钻头，向股骨头方向打孔，深度为4 mm，用小刮匙刮除股骨头内骨质，造成约50%的缺损，然后用液氮持续冷冻股骨头，约5 min。

1.2.2 实验分组并植入材料 动物术毕后行影像学检测，确认造模成功后随机分为A、B、C、D 组，每组12只。A组为造模组，不做处理，复温后立即逐层关闭切口；B、C、D组动物在造模复温后沿向钻孔内分别填塞体积为3 mm×3 mm×3 mm大小的DBM、DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM，医用凝胶海绵封闭隧道口，逐层关闭切口；术后各组动物臀大肌注射青霉素钠预防感染(每只兔40万U/d，连续3 d)。

1.2.3 RT-PCR法检测骨股头BMP-2基因表达 4、8、12 周各组分别处死4只兔子，取出股骨，清除表面组织，沿基底部将股骨头锯掉后矢状剖开，取部分股骨头样品放入研钵，加入液氮，研磨成粉末后加入1.5 ml EP管,按照总RNA提取试剂盒(离心柱型)操作步骤操作，并通过凝胶电泳行质量检测，使用分光光度计进行纯度浓度测定，计算出RT-PCR反应体系(20 μl体系)中所需1 μg RNA所需的体积量。使用PCR仪与M-MLV First Strand Kit试剂盒合成cDNA。根据BMP-2的基因序列利用primer 5.0合成引物，FP:5′-ACTACCAGAAACGAGTGGGAA -3′，RP：5′-GCATCTGTTCGGAAAACCT-3′；GAFDH的FP:5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′，RP：5′-G TGGTTCACACCCATCACAA-3′,然后使用PCR仪与2×Taq PCR MasterMix试剂盒进行PCR扩增，94 ℃ 2 min，(94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)×30个循环，72 ℃ 2 min。扩增完毕后，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(U：140 V；I:175 mA；T：30 min)，凝胶图像分析系统拍照并分析其表达量,以目的/内参来分析各组的基因表达情况。

1.2.4 微观形貌观察与能谱分析 取4、8、12 周的4组标本和一块正常兔股骨头标本，每个标本剖面随机挖取3块1.0 mm×1.0 mm×0.5 mm的样本，浸入双蒸水震荡30 min，共3次；4%多聚甲醛固定15 min；25%、50%、75%、95%、100%乙醇溶液各脱水15 min，自然晾干；真空镀膜仪喷金处理；置入Quanta 200 FEG场发射环境扫描电镜和X-射线能谱仪，电镜观察样品表面微观形貌，X线能谱分析仪(energy dispersive spectrometer，EDS)测定微区主要元素(碳、氮、氧、钙、硫、磷)的重量百分比和原子百分比百分含量，重复3次，然后计算钙磷比(Ca/P)。

2 结果

2.1 BMP-2表达情况 凝胶成像分析系统显示：DNA Marker大小为100～600 bp，GAPDH大小为221 bp，目的条带(BMP-2)大小为180 bp。各组标本在各时间点均有BMP-2基因的表达，见图1。凝胶成像系统辉度分析显示：术后4 、8 、12周，A、B、C、D组内BMP-2表达量依次递增；术后各时间点A、B、C、D组之间的BMP-2表达量为A组

表1 各时间点各组BMP-2基因表达量(目的/内参，

2.2 SEM与EDS 电镜下正常骨组织板层结构致密、完整、排列方向一致，钙化良好，表面光滑，板层之间纤维成交交错，未见骨板断裂、扭曲等现象，见图2a。4周时，A组骨板裂痕仍然清晰，出现纤维增生；8周时见骨小梁变细，部分断裂，纤维增生较前增加，欠规则，未见钙化颗粒；12周时见大量扭曲纤维增生充满视野，表面未见钙化物，骨小梁大部分消失，无明显新生成骨表现，见图2b。B、C两组在4 ～8周时可见骨小梁变细，但未出现大量断裂现象，骨小梁表面出现“云翳状覆盖物”，覆盖物表面出现钙化颗粒沉积；12周时可见纤维表面钙化颗粒进一步增多，部分钙化颗粒堆积成团块，附着于骨小梁上，但是新生骨小梁形态欠佳，新生骨板结构不整，仍不成熟，如图2c、2d。D组在4周时出现大量新生胶原纤维，形态规则，方向一致，表面可见颗粒性钙化物，出现低钙化类骨质；8周时钙化物电子密度进一步增大，低密度类骨质逐渐融合成粗大骨小梁，骨小梁表面细胞渐丰富；12周时新生骨继续改建，新生骨板致密、规则，骨小梁结构趋向正常，并出现规则的骨陷窝及骨细胞，与正常骨组织形态大致相同，见图2e。

正常骨组织的主要成分为钙、磷酸盐沉积，Ca、P含量较高，且Ca含量高于P。EDS中Ca波峰高度大于P，Ca元素峰覆盖面积约为P元素峰覆盖面积的两倍，即Ca/P=2.06，见图3a。A组在4 ～12 周的钙磷含量均较低，各元素水平未见明显变化，Ca/P为0.82，见图3b。B、C两组在4 周时钙磷含量较低；8 周时Ca、P元素含量增加，但P元素增加快于Ca元素；12 周时Ca、P元素含量进一步上升，P元素增速明显减慢，各元素含量处于比较稳定状态，Ca含量超过了P元素，B组Ca/P=1.33,C组Ca/P=1.52，见图3c、3d。D组在4 周时即见到Ca、P元素含量增加，其中P元素增加较快，呈双峰；8 周时Ca、P元素仍然迅速增加，但Ca元素增加速度大于P，Ca/P达到2.85；12 周时Ca、P含量增速变缓，各元素含量逐渐稳定，Ca/P=1.99，与正常骨组织含量及Ca/P无较大差异，见图3e。

图1 PCR检测各组的BMP-2基因表达

图2 12周SEM观察 ×10 000

A：正常骨股骨头组织；b:A组;c:B组;d:C组;e:D组

图3 12周能谱分析

A：正常骨股骨头组织；b：A组；c：B组；d：C组；e：D组

3 讨论

研究[9]表明，BMSCs有多向分化能力、免疫原性小、增殖能力强、来源充足、取材广泛等优点，目前在组织工程和临床上已经广泛使用。BMP有诱导成骨作用，其中BMP-2成骨诱导作用最强，是最有前途的骨诱导物质[10]；DBM具备良好的黏附率和孔隙率，利于种子细胞的黏附和生存，并且其取材于正常骨组织，有良好的生物组织相容性，是比较理想的生物支架材料[11-12]。本研究根据基因工程和组织工程原理采用腺病毒介导hBMP-2转染兔BMSCs复合DBM的方法体外构建组织工程骨，然后将该组织工程骨植入兔ONFH模型中进行观察研究以评估Ad-BMP-2/BMSCs/DBM对ONFH的效果。

RT-PCR技术可以在短时间内扩增出足量的DNA以供研究，有特异性高、敏感性高、易自动化等优点，是组织工程中重要的检测手段[13]。PCR和凝胶成像系统显示4～8周 A组BMP-2均有微弱表达，提示其有微弱修复作用，12周时BMP-2表达量较前降低，可能为修复停止，骨小梁坏死、吸收所致。B、C、D组在各时间点BMP-2均有大量表达，且D组表达量远大于B、C两组，提示DBM、BMSCs/DBM、hBMP-2/BMSCs/DBM对股骨头坏死都有修复作用，但hBMP-2/BMSCs/DBM对股骨头坏死的修复作用明显优于DBM、BMSCs/DBM组。

SEM利用电子束在样品上逐点逐行扫描，直接观察其表面形貌，是一种理想的超微结构表面特征分析手段[14]。经过电镜扫描成像可见A组结构混乱，已经看不到完整骨小梁结构及骨细胞，B、C两组镜下可见骨小梁及低分化类骨质，D组可见大量规则骨小梁、细胞丰富，与正常骨组织类似，提示D组修复效果明显大于前3组。

体内骨生成包括成骨细胞分化增殖,骨基质分泌,钙盐沉积和骨组织结构改建成熟等过程。EDS 是一种以一定能量的加速粒子轰击待分析样品，从样品中激发出特征射线，以显示出活体组织的形态学影像及相应的元素分布图，从而确定样品中各元素的种类和含量的方法，成为显微分析不可缺少的一部分[15]。EDS显示4～12周 A组Ca、P元素含量较低，且没有任何变化，可能为ONFH吸收后没有得到修复；B、C两组4～12周 Ca、P含量有一定变化，且较A组有所增高，但Ca、P含量和Ca/P始终低于D组，提示两组股骨头均有不同程度的骨修复；D组Ca、P含量经过降低、快速增加、缓慢增加、趋于稳定的过程，Ca/P经过降低、激增、回复正常的过程。Ca、P元素及Ca/P的变化提示D组股骨头经过了成骨分化过程，得到了良好修复。

本研究结果提示：在黏附率、孔隙率及相容性合适的支架上，hBMP-2基因等细胞因子高效持续表达，不断地诱导BMSCs向骨细胞分化，促使组织工程骨修复坏死的股骨头区域，进而达到临床治愈ONFH的目的。本研究通过组织工程方法在成骨方面已经取得一定成效，但是在成骨的同时亦发现其成血管能力较弱，如何在成骨的同时增加血管的再生能力仍然是一个值得探索和研究的内容。

综上所述，hBMP-2/BMSCs/DBM对ONFH有明显的修复作用，且其修复效果远远优于DBM和BMSCs/DBM。BMSCs在BMP-2的诱导下可以持续向骨细胞分化，产生新生骨组织，填充坏死区域，防止股骨头塌陷，对早期ONFH的治疗有良好的应用前景，为临床治疗ONFH提供了新的思路和方法，值得进一步探讨和研究。

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Experimental study on the repair of Ad-BMP-2/BMSCs/DBM for rabbits’ femoral head necrosis

Shi Zhengsong,Li Qiang,Ning Yinkuan,et al

(Dept of Emergency Traumatic Surgery,The Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541001)

Objective To evaluate the effect of the Ad-BMP-2/BMSCs/DBM for rabbits’ femoral head necrosis by the RT-PCR, SEM and EDSand explore the new treatments for femoral head necrosis.Methods ① Prepare femoral head necrosis models by clinical core decompression combined with liquid nitrogen frozen.② After building models,animals were randomly divided into 4 groups(n=12) as follows:group A was not implanted anything as control group,group B was implanted into DBM,group C was implanted into hBMP-2/DBM,group D was implanted into hBMP-2/BMSCs/DBM.③ Four rabbits of each group were killed at 4,8,12 weeks after surgery to evaluate the reparation of ONFH through the RT-PCR,SEM and EDS. Results The RT-PCR showed: the expression of BMP-2 in group A

osteonecrosis of femoral head;bone marrow mesenchymal stem cells; bone morphogenetic protein -2;RT-PCR;SEM;EDS

时间：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.028.html

国家自然科学基金(编号：31160199)；广西自然科学基金(编号：2014jjAA40064)

桂林医学院附属医院急诊创伤外科，桂林 541001

石正松，男，硕士研究生；

李 强，男，主任医师，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：li.q12251970@163.com

R 687.34

A

1000-1492(2016)01-0059-05

2015-09-30接收