栀子柏皮汤不同配伍对四氯化碳诱导肝纤维化小鼠的治疗作用

钱正月，李 俊，黄 成，孟晓明，马陶陶，陈昭琳



◇药学研究◇

栀子柏皮汤不同配伍对四氯化碳诱导肝纤维化小鼠的治疗作用

钱正月1,2,3，李 俊1,2,3，黄 成1,2,3，孟晓明1,2,3，马陶陶1,2,3，陈昭琳1,2,3

目的 研究栀子柏皮汤不同配伍组合的抗肝纤维化药理作用。方法 采用四氯化碳(CCl4)引起的肝纤维化小鼠模型观察栀子柏皮汤各配伍组的抗肝纤维化作用，同时给予不同配伍的栀子柏皮汤进行灌胃治疗。生化检测相关肝纤维化及炎症指标，运用Masson染色和HE染色检测肝纤维化的变化，Western blot 法检测Ⅰ型胶原及α-横纹肌肌节肌动蛋白(α-SMA)的表达水平。结果 栀子柏皮汤及各配伍组均可不同程度的降低小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶 (AST)、羟脯氨酸(Hyp)及透明质酸(HA)水平，改善肝脏的病理变化，其中栀子黄柏甘草配伍组抑制 CCl4诱导的小鼠肝纤维化效果最佳(P<0.01)，并能显著抑制肝组织中Ⅰ型胶原和α-SMA的蛋白表达(P<0.01)。实验结果表明栀子柏皮汤亦可明显降低血清中转化生长因子β(TGF-β)的表达水平。结论 栀子柏皮汤不同配伍组能不同程度改善小鼠肝纤维化，但栀子黄柏甘草配伍，即全汤组抗肝纤维化作用最明显，并且栀子柏皮汤的抗肝纤维化作用可能与降低TGF-β水平有关。

栀子柏皮汤；配伍；肝纤维化；α-平滑肌肌动蛋白

肝纤维化是因多种原因诱导所引起的慢性肝脏类疾病，若不积极治疗，将发展为肝硬化甚至肝癌。此类疾病已引起越来越广泛的重视,但在临床工作中尚无有效的药物治疗方法，因而越来越多的人把目光转向了中药治疗。栀子柏皮汤源自汉代名医张仲景著的《伤寒论》，由栀子、黄柏和甘草按照君臣佐使的配伍原则以10 ∶6 ∶3的比例煎煮而成，主要用于治疗湿热黄疸、抗炎解热等[1]。栀子柏皮汤在肝脏疾病治疗方面已见一些报道[2-3]，但其在肝纤维化小鼠模型的配伍方面研究较少。并且该研究采取的四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝纤维化模型用作抗肝纤维化药物的筛选和评价已见诸多报道[4]。该研究探讨了栀子柏皮汤不同成分配伍对CCl4诱导的肝纤维化小鼠的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康ICR小鼠90只，普通级，雄性，(20±2)g，由安徽医科大学实验动物中心提供。小鼠饲养在笼中，隔天更换饲料饮水，自由饮水和摄食，保持室温(22±1)℃，相对湿度 40%～60%，常规饲养观察 1 周后用于实验。

1.2 药品与试剂 栀子柏皮汤的主要成分栀子、黄柏和甘草均购自安徽医科大学第一附属医院药剂科，由安徽医科大学药学院金涌教授鉴定为正品。谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)测定试剂盒、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)测定试剂盒 、羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；透明质酸(hyaluronic acid, HA) 测定试剂盒、转化生长因子-β(transfoming growth factor-β,TGF-β)购自上海源叶生物有限公司；Ⅰ型胶原购自美国Southernbiotech公司；α-横纹肌肌节肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)购自北京Bioss公司。

1.3 分组造模与药物制备 90只小鼠随机分为6组：正常组、模型组、栀子组、栀子+黄柏组、栀子+甘草组、栀子+黄柏+甘草组，每组各 15只。将小鼠皮下注射 20% CCl4(2 ml/kg，用橄榄油1 ∶4稀释)，每周2次，持续4周，形成稳定的肝纤维化动物模型。从注射第3周开始采用栀子柏皮汤各配伍组灌胃给药14 d(每周2次，持续2周)，正常组给予等体积的橄榄油，直至4周实验结束时停止给药。各组均于4周后麻醉处死小鼠，解剖后从腹主动脉取血，4 ℃保存及时检测，并且收集肝脏标本，生理盐水洗涤后一部分用4%多聚甲醛固定待用，另一部分肝脏标本采用液氮速冻并置于-80 ℃保存备用。

称取栀子50 g，一煎加药材量的8倍水，沸腾后煎30 min，20层纱布过滤，再煎加药材量的8倍水，沸腾后再煎20 min，过滤，两煎所得滤液混合后蒸馏浓缩至原生药量1 g/ml，4 ℃保存待用，此为栀子组。称取栀子50 g、黄柏30 g，同以上方法煎煮，制成约合原生药量1 g/ml 浓缩液，此为栀子+黄柏组。再次分别称取栀子50 g、甘草15 g，以及栀子50 g、黄柏30 g、甘草15 g，浓缩所得分别为栀子+甘草组、栀子+黄柏+甘草组。

1.4 血清学肝功能测定以及肝纤维化指标、炎症指标的检测 取血后室温静置1 h，3 000 r/min离心15 min，分离血清。分别按试剂盒操作检测ALT、AST、Hyp、HA以及TGF-β。

1.5 Western blot 检测各组肝脏组织中Ⅰ型胶原和α-SMA蛋白的表达 取适量肝组织置冰冷的裂解液中收取总蛋白，用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量后，蛋白样品与上样缓冲液共同煮沸10 min。采用5%浓缩胶和10%分离胶，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳并转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭3 h。分别与Ⅰ型胶原和α-SMA一抗4 ℃孵育过夜；二抗1 ∶10 000，内参采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。ECL发光试剂显影，灰度成像软件测定光密度值以计算蛋白表达水平。

1.6 肝脏组织病理学检查 用4%多聚甲醛溶液固定的肝组织，经常规脱水后，石蜡包埋、切片，进行HE染色和Masson染色，在荧光显微镜下观察肝组织纤维化程度。

2 结果

2.1 小鼠生存状态比较 正常组小鼠4周内反应灵活，活动正常，饮食饮水正常，毛发无脱落受损。与正常组相比，模型组随着造模时间延长，反应迟钝，厌食少动，毛发散乱，生活状态比正常组明显下降。但是与模型组相比，加药组小鼠生活状态有所改善。

2.2 小鼠血清学肝功能指标的变化 与正常组比较，模型组血清中ALT、AST活性显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，栀子柏皮汤组能显著降低小鼠血清ALT、AST的含量，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 栀子柏皮汤及其配伍组对肝纤维化模型小鼠血清ALT、AST 水平的影响

与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较:#P<0.05，##P<0.01

2.3 小鼠肝组织病理学变化的影响 组织病理学分析结果显示，正常组小鼠肝组织结构正常，肝细胞呈索状排列结构清晰，肝细胞无明显坏死情况，未见肝窦异常、脂肪变性和坏死。而模型组肝损伤较重，间质明显增生，肝细胞索状排列紊乱，清晰可见肝细胞点状坏死以及炎性细胞浸润，纤维间隔明显形成，胶原明显沉积。但使用栀子柏皮汤不同配伍组治疗后，肝细胞坏死以及炎性细胞浸润有所减少，中央静脉和汇管区仅存在少许胶原纤维，肝细胞坏死以及纤维组织增生情况明显改善，见图1。以上结果表明栀子柏皮汤各配伍组均可不同程度地改善CCl4诱导的小鼠肝脏的病理损伤。

2.4 小鼠肝纤维化指标的变化 与正常组相比，模型组小鼠血清HA和Hyp的含量显著增加(P<0.05)，但是与模型组相比，加药组则明显降低，栀子+黄柏+甘草组降低更明显，但还未恢复到正常水平(P<0.01)。以上结果表明，栀子柏皮汤各配伍组均可不同程度地降低HA和Hyp的血清含量，进一步提示栀子柏皮汤可能对纤维化的治疗有一定作用，见图2。

图1 栀子柏皮汤及其配伍组对 CCl4致肝纤维化小鼠肝组织病理变化的影响 ×100

2.5 小鼠肝组织Ⅰ型胶原和α-SMA蛋白的表达变化 Western blot检测结果显示，与正常组相比，模型组两种蛋白的相对密度值均显著升高(P<0.05)；而与模型组相比，加药组明显下调两种蛋白的表达，栀子+黄柏+甘草组降低更明显，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。以上结果表明，栀子柏皮汤各配伍组可不同程度地降低肝纤维化相关蛋白Ⅰ型胶原和α-SMA的表达，进一步证明了栀子柏皮汤可能对肝纤维化有一定程度的治疗作用。

2.6 小鼠血清中TGF-β活性的变化 用ELISA法检测小鼠血清中TGF-β的变化，模型组小鼠血清中TGF-β活性显著高于正常组(P<0.01)，与模型组比较, 栀子柏皮汤各配伍组能显著降低小鼠血清TGF-β的含量(P<0.01)，提示栀子柏皮汤对肝纤维化的治疗作用可能与降低TGF-β的活性有关，见图4。

图2 栀子柏皮汤及其配伍组对肝纤维化模型小鼠血清HA以及Hyp水平的影响

A：血清中HA含量；B：血清中Hyp含量；1：正常组；2：模型组；3：栀子组；4：栀子+黄柏组；5：栀子+甘草组；6：栀子+黄柏+甘草组；与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：##P<0.01

图3 栀子柏皮汤及其配伍组对CCl4致肝纤维化小鼠肝组织Ⅰ型胶原和α-SMA蛋白变化的影响

1：正常组；2：模型组；3：栀子组；4：栀子+黄柏组；5：栀子+甘草组；6：栀子+黄柏+甘草组；与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01; 与模型组比较：##P<0.01

图4 栀子柏皮汤及其配伍组对肝纤维化模型小鼠血清TGF-β水平的影响

1：正常组；2：模型组；3：栀子组；4：栀子+黄柏组；5：栀子+甘草组；6：栀子+黄柏+甘草组；与正常组比较：**P<0.01; 与模型组比较:#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

肝纤维化是由多种因素引起肝细胞坏死，纤维结缔组织沉积异常而导致的慢性肝脏损伤。而注射CCl4诱导的肝纤维化模型是最常用的肝纤维化模型[5]。本实验结果表明，与正常组比较，模型组小鼠血清ALT、AST以及HA、Hyp水平明显升高，组织病理学分析结果显示，模型组小鼠肝损伤较重，并且模型组Ⅰ型胶原和α-SMA蛋白的表达水平也明显升高。以上结果说明CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型已成功复制。迄今为止，虽然治疗肝纤维化的药物繁多，但治疗效果并不理想，因而中药治疗成为研究和临床治疗的热点。栀子柏皮汤用于治疗肝脏类疾病历史悠久，但其在肝纤维化小鼠模型的配伍研究方面却鲜见报道，本实验主要从这些方面展开研究。

造模期间，模型组小鼠的行为习惯均异于正常组，表现出行动迟缓，毛发散乱，厌食少动，而加药组小鼠则表现得相对正常。当肝脏受到损害，肝功能发生改变，通过检测肝细胞内相关酶的变化可对肝细胞的受损程度进行评价，目前常用的检测指标有ALT、AST等[6]。血清学研究结果表明，模型组小鼠ALT、AST 水平均明显高于正常组，与模型组相比，加药组均可不同程度降低ALT、AST水平，并且栀子、黄柏和甘草三种药物的配伍组保护作用更明显，初步证明其对CCl4所致的小鼠肝纤维化可能有不同程度地保护作用。组织病理学分析结果进一步证实了以上结论，与正常组相比，模型组胶原沉积，纤维组织增生，肝小叶结构破坏严重。与模型组相比，加药组则趋向于正常，肝纤维化程度明显减轻。HA和Hyp是目前肝纤维化的主要血清标志物，其升高程度与纤维化和炎症程度呈正相关[7]。本研究显示与正常组相比，模型组小鼠血清HA和Hyp的含量显著增加，表明模型组肝纤维化的形成和炎症的产生，但是与模型组相比，加药组则明显降低，表明加药后小鼠的肝纤维化程度和炎症程度有所减轻。Ⅰ型胶原、α-SMA的表达水平是反映药物对肝纤维化治疗效果的直接指标[8]。而蛋白表达水平表明，与正常组相比，模型组蛋白表达明显升高，加药后，蛋白表达较模型组呈降低的趋势。上述结果说明，栀子柏皮汤能降低肝脏损伤的程度，抑制肝纤维化的进展。

TGF-β被普遍认为是主要的促肝纤维化细胞因子，其表达水平可反映肝纤维化程度及组织炎症坏死程度[9]。本研究中也发现，与正常组相比，模型组TGF-β的表达显著升高，而加药组其表达呈逐渐降低趋势，并且栀子、黄柏和甘草组作用最佳。因此，本研究认为栀子柏皮汤可能是通过调节小鼠肝脏TGF-β的表达来发挥其抗肝纤维化的作用。

本研究结果证明了在 CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中，栀子柏皮汤能够明显抑制肝脏纤维化的进展，减轻肝脏的损伤，并且在本实验中，栀子、黄柏、甘草的配伍组合治疗效果最佳，进一步证实了传统汤剂配伍的合理性。

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Therapeutical effects of Zhizi Bopi Decoction and its compatibility on CCl4induced hepatic fibrosis in mice

Qian Zhengyue1,2,3, Li Jun1,2,3, Huang Cheng1,2,3, et al

(1School of Pharmacy,Anhui Medical University,2Anhui Key Laboratory of Bioactivity of Natural Products,3Anhui Institute of Innovative Drugs, Hefei 230032)

Objective To study the anti-hepatofibrotic effects of Zhizi Bopi Decoction and its compatibility on liver fibrosis. Methods The model of mouse liver fibrosis which was induced by carbon tetraehlofide (CCl4) was used to investigate the effects of Zhizi Bopi Decoction and its compatibility by gavage. Indicators of hepatic fibrosis and inflammation were detected with automated biochemistry analyzer and liver fibrosis of the mice was assessed by Masson staining and HE staining. Meanwhile, the protein levels of collagen typeⅠ and α-smooth muscle actin (α-SMA) were evaluated by Western blot analysis. Results Zhizi Bopi Decoction and each different treatment group could evidently inhibit the increased serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), hydroxyproline (Hyp) and hyaluronic acid (HA) activities, and improve the pathological changes of mouse livers. Furthermore, the therapeutic effects on liver fibrosis induced by CCl4in mice were primarily ascribed to the synergic effect ofGardeniajasminoidesEllis,CortexphellodendriandGlycyrrhizaeRadixetRhizoma(P<0.01). And they could obviously reduce the protein expression levels of collagen typeⅠ and α-SMA in the liver (P<0.01). In addition, Zhizi Bopi Decoction could also obviously reduce the contents of transforming growth factor-beta (TGF-β). Conclusion Zhizi Bopi Decoction and its compatibility all perform significant anti-fibrotic effects on the liver in different degree, but the compatibility ofGardeniajasminoidesEllis,CortexphellodendriandGlycyrrhizaeRadixetRhizomaexert the most distinctly anti-fibrotic effects among them, possibly by reducing the contents of TGF-β.

Zhizi Bopi Decoction; compatibility; hepatic fibrosis; α-SMA

时间：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.032.html

国家自然科学基金(编号:81473526、81202978)；高等学校博士学科点专项基金(编号:20123420120001)；安徽省科技攻关计划(编号:1301042212)；安徽省自然科学基金(编号:1308085MH145)

1安徽医科大学药学院、2安徽天然药物活性研究省级实验室、3安徽创新药物产业共性研究院，合肥 230032

钱正月，女，硕士研究生；

李 俊，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail:lj@ahmu.edu.cn

R 285

A

1000-1492(2016)01-0068-05

2015-10-22接收