缬沙坦对糖尿病大鼠足细胞保护作用的研究

黄珍珍，任 伟，王 艳，陈玉米，叶山东，邢 燕，胡 闻



缬沙坦对糖尿病大鼠足细胞保护作用的研究

黄珍珍1，任 伟1，王 艳1，陈玉米1，叶山东2，邢 燕2，胡 闻3

目的 观察缬沙坦对糖尿病大鼠足细胞相关蛋白表达的影响，探讨肾素-血管紧张素系统(RAS)抑制剂保护糖尿病大鼠足细胞的机制。方法 将36只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组和实验组。实验组使用链脲佐菌素(STZ)诱导建立糖尿病大鼠模型，随机将其分为糖尿病模型组、缬沙坦干预组。8周后分别检测各组大鼠糖化血红蛋白(HbA1C)、尿白蛋白(UALB)、尿肌酐(UCR)、尿视黄醇结合蛋白(URBP)及肾脏肥大指数(KI)的变化，并计算尿白蛋白/肌酐(UACR)和尿视黄醇结合蛋白/肌酐(UBCR)，每周监测各组血糖(BG)；8周后利用光镜及电镜观察大鼠肾脏病理及足细胞形态变化；采用免疫组化、RT-PCR法分别检测肾组织Podocin蛋白和 mRNA的表达。结果 与正常对照组比较，糖尿病模型组和缬沙坦干预组糖尿病大鼠BG、HbA1C、UACR、UBCR、KI均明显增高(P<0.01)，肾脏皮质Podocin mRNA及肾组织Podocin蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)，肾脏肾小球体积增大，基底膜增厚，足细胞病变较重；与糖尿病模型组比较，缬沙坦干预组除BG及HbA1C外，UACR、UBCR、KI均明显降低(P<0.01)，肾脏皮质Podocin mRNA及肾组织Podocin蛋白表达水平增高(P<0.01)，肾小球、小管间质、基底膜及足细胞的病理损伤减轻。结论 缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏足细胞有明显的保护作用，其部分机制可能是通过上调肾组织Podocin mRNA和蛋白表达。

糖尿病肾病；足细胞；Podocin；缬沙坦

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是导致终末期肾脏疾病的重要原因，也是糖尿病患者最主要的微血管病变之一。临床识别糖尿病肾病的早期指标之一即微量蛋白尿，且蛋白尿可导致DN快速进展。近年来，足细胞的损伤在糖尿病肾病蛋白尿产生中的作用越来越受到关注。足细胞又名肾小球脏层上皮细胞，是肾小球滤过屏障的一部分，研究[1]表明足细胞裂孔隔膜上的足细胞相关蛋白如Podocin、Nephrin表达及分布异常是导致DN蛋白尿形成的重要原因，并对维持肾小球滤过膜的完整性至关重要[2]。该研究通过观察缬沙坦对糖尿病大鼠足细胞超微结构的变化、肾组织足细胞分子Podocin表达的影响，进一步探讨缬沙坦对减少尿蛋白和肾脏足细胞保护作用的关系，旨在阐明缬沙坦对糖尿病肾病足细胞保护作用机制，为糖尿病肾病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠36只，8周龄，体重(180±20)g，由安徽医科大学实验动物中心提供。

1.2 动物模型制备 适应性喂养1周后，将36只SD大鼠随机分为正常对照组(n=10)、实验组(n=26)。禁食12 h后，实验组大鼠空腹状态下给予链尿佐菌素(streptozotocin，STZ)(美国Sigma公司)65 mg/kg腹腔一次性注射制备糖尿病大鼠模型，48～72 h后大鼠尾静脉采血，随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠造模成功标准。最终20只造模成功，再将其随机分为两组：糖尿病模型组与缬沙坦干预组，每组10只。缬沙坦干预组每日给予缬沙坦(北京诺华制药有限公司，80 mg/粒) 20 mg/(kg·d)灌胃，正常对照组和糖尿病模型组每天仅予以灌服等量的饮用水，连续8周。每周检测大鼠血糖，对血糖≥33.3 mmol/L大鼠皮下注射适量胰岛素。

1.3 标本收集与测定 各组大鼠于8周后留随机尿标本，保存于-40 ℃冰箱，用于测定尿白蛋白(urine albumin，UALB)、尿视黄醇结合蛋白(urine retinol binding protein，URBP)、尿肌酐(urine creatinine，UCR)，并且为消除随机尿标本尿量对实验结果的影响，将UALB和URBP以UCR进行校正，简称为尿白蛋白/尿肌酐(UACR)、尿视黄醇结合蛋白/尿肌酐(UBCR)。大鼠处死前称体重，在10%水合氯醛麻醉下经腹主动脉采血，用HPLC法测糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1C)。处死大鼠，称重左肾，测肾脏肥大指数(kidney hypertrophy index，KI)：左肾重/体重(mg/g)，并将其制备后用于光镜和电镜检测。留取右肾，分离肾脏皮髓质，速冻于液氮中保存备用。

1.4 免疫组化检测 采用Elivision法检测肾组织中Podocin蛋白表达。将石蜡包埋的肾组织切片脱蜡、微波修复，3%过氧化氢孵10 min，滴加兔抗大鼠多克隆Podocin抗体(北京博奥森公司)，阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗干净，滴加抗兔IgG，显微镜下控制DAB溶液染色时间，阳性部位呈棕黄色，苏木精复染，脱水、干燥、透明，中性树胶封片。每张切片在400倍下随机采集10个连续不重复的视野，阳性物质的相对含量用全自动图像分析系统( Image Pro Plus 6.0)通过测量平均光密度值(average opticaldensity，AOD)来表达，作为各观察标本的Podocin表达水平。

1.5 RT-PCR法检测 肾皮质总RNA提取按Trizol试剂说明书进行。取2 μg RNA在逆转录酶催化下合成cDNA，用Podocin引物对cDNA进行半定量PCR扩增。Podocin上游引物：5′-TCAAGCCCTCTGGATTAG-3′， 下游引物： 5′-CTTCATGGTGGTTTGCAT-3′，产物392 bp。反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，72 ℃终末延伸5 min，共30个循环。将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，以GAPDH作为内参，用Biosens 805型凝胶图像分析软件检测电泳条带的吸光度值，测定不同组大鼠肾皮质Podocin mRNA表达情况。

1.6 肾脏病理检查 光镜：肾组织标本经4%多聚甲醛固定、浸蜡、包埋，2 μm厚度连续切片，HE染色，光镜下观察肾小球、肾小管的形态结构。透射电镜：肾皮质切成约1 mm3大小组织块，2.5%戊二醛固定，漂洗、脱水、切片，透射电镜下观察足细胞变化，并测定肾小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)平均厚度、足突融合率、足突平均宽度(foot process width，FPW)。

2 结果

2.1 各组一般指标变化 8周后，与正常对照组比较，糖尿病模型组和缬沙坦干预组大鼠血糖、HbA1C、UACR、UBCR、KI均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与糖尿病模型组比较，缬沙坦干预组血糖及HbA1C差异无统计学意义(P>0.05)，UACK、UBCR、KI均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2 各组肾组织病理指标变化 光镜：正常对照组大鼠肾小球、肾小管及小管间质形态结构清楚，未见明显病理学改变；糖尿病模型组肾小球体积增大，系膜基质增生，基底膜弥漫增厚；缬沙坦干预组上述病理改变较糖尿病模型组明显得到改善。电镜：正常对照组足细胞结构正常，基底膜均匀，无增厚；糖尿病模型组足突增宽、融合，足细胞数减少、甚至消失，基底膜增厚；与糖尿病模型组比较，缬沙坦干预组上述病变程度有不同程度减轻，可见足细胞数恢复，少量足突细胞融合，基底膜无明显增厚。见图1。第8周，与正常对照组比较，糖尿病模型和缬沙坦干预组大鼠肾小球GBM平均厚度、足突融合率、FPW明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；缬沙坦干预组上述指标与糖尿病模型组比较明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表1 各组大鼠8周末一般指标变化

与正常对照组比较：**P<0.01；与糖尿病模型组比较：##P<0.01

表2 各组大鼠8周末电镜观察结果

与正常对照组比较：**P<0.01；与糖尿病模型组比较：##P<0.01

图1 各组大鼠肾组织染色结果

图2 免疫组化检测各组大鼠肾脏Podocin表达 ×400

2.3 各组Podocin蛋白水平变化 8周后，可见正常对照组 Podocin沿肾小球毛细血管袢呈线性分布，且强阳性表达；糖尿病模型组Podocin分布不均匀，表达明显减弱或缺失，AOD值明显低于正常对照组(2.42±0.28vs5.38±0.10，P<0.01)；与糖尿病模型组比较，缬沙坦干预组Podocin表达增加，AOD值明显高于糖尿病模型组(4.53±0.33vs2.42±0.28，P<0.01)。见图2。

2.4 各组Podocin mRNA水平变化 8周后，各组大鼠肾皮质中Podocin mRNA水平AOD分析显示，糖尿病模型组大鼠肾皮质表达显著低于正常对照组(0.498±0.075vs0.982±0.051，P<0.01)；缬沙坦干预组大鼠表达显著高于糖尿病模型组(0.668±0.025vs0.498±0.075，P<0.01)。见图3。

3 讨论

DN是糖尿病的重要并发症，而且大多数DN将最终发展成为终末期肾脏疾病[3]。早期DN的主要临床检测指标为尿微量白蛋白，而DN时蛋白尿的发生发展关键因素为肾小球滤过屏障功能出现障碍，肾小球滤过屏障由内皮细胞、GBM和足细胞组成[4]。足细胞通过稀疏的足突附着于肾小球基底膜，而足细胞间的裂孔隔膜在肾小球选择性滤过屏障中发挥着至关重要的作用[5]。其中Podocin是存在于裂孔隔膜上的重要分子，也是继Nephrin之后被发现的一种跨膜蛋白，属Stomatin家族，原位杂交显示Podocin的编码基因NPHS2几乎全部表达在肾小球足细胞，而在其他组织部位未见表达[6]。

图3 各组大鼠肾皮质Podocin mRNA表达

A：GAPDH；B：Podocin；1：正常对照组；2：糖尿病模型组；3：缬沙坦干预组；与正常对照组比较：**P<0.01；与糖尿病模型组比较：##P<0.01

Podocin与Nephrin密切关联，参与细胞内信号传导通路，基因突变分析提示足细胞功能异常和蛋白尿的发生与Nephrin-Podocin信号传导异常密切相关[7]。研究[8-10]显示Podocin表达减少和分布异常可导致严重的蛋白尿、肾功能损伤及肾小球足突的融合，并且与蛋白尿程度呈负相关性。Baelde et al[ 11]发现，DN患者Podocin蛋白表达降低，且其表达减少与尿蛋白增加相关。因此观察Podocin在肾组织的表达有重要意义。本研究8周时观察到糖尿病模型组大鼠肾组织Podocin蛋白及Podocin mRNA表达显著减少，肾脏病理损伤较重，出现足细胞数减少，足突增宽、融合，甚至消失，提示Podocin在维持足细胞的形态和功能上有重要意义。

目前肾脏疾病领域，治疗DN蛋白尿的主要药物为肾素-血管紧张素(renin angiotensin system，RAS)抑制剂，并且研究[12]显示其作用机制除降低血压、改善血流动力学外，还与其足细胞的保护作用有关。Wang et al[13]通过检测发现DN患者尿沉渣中足细胞相关分子(Nephrin和Podocin)的表达升高，应用血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体阻滞剂(angiotensin receptor blockers，ARB)治疗后可减少尿沉渣中Nephrin排泄量，且尿液中Podocin表达的改变可能与DN预后有关。本研究选取的缬沙坦作为ARB类药物可通过阻断血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)与血管紧张素Ⅱ1受体结合而抑制AngⅡ的致病作用。研究[14]显示缬沙坦等RAS抑制剂不但对伴高血压的DN患者有显著减少蛋白尿的作用，而且还对血压正常的DN患者蛋白尿有降低功效，提示RAS抑制剂可能存在独立于降压之外的降低DN蛋白尿的肾保护作用。另外，DN动物模型的实验[15]结果也显示，RAS抑制剂在不同程度减少DN相关的nephrin在肾组织表达的同时可产生缓解蛋白尿的作用。

本研究进一步观察了缬沙坦对糖尿病大鼠的尿蛋白、肾脏病理及足细胞超微结构、肾组织Podocin蛋白表达的变化。结果显示，糖尿病模型大鼠经缬沙坦治疗8周后，UALB、URBP排泄量及KI水平显著低于糖尿病模型组；光镜和电镜下可见肾小球、肾小管间质病理损伤得到缓解，足细胞肥大、凋亡，足突融合、消失，基底膜增厚等病理变化明显改善；肾组织Podocin基本可恢复连续的线性分布，并且表达强度较糖尿病模型组明显上调，提示缬沙坦对糖尿病大鼠肾组织有明显的保护作用，考虑与缬沙坦可能通过阻断Podocin表达下调，减轻足细胞损害，保护滤过膜的结构与功能，从而改善蛋白尿。另外，本实验显示8周时糖尿病模型组、缬沙坦干预组血糖和HbA1C水平差异无统计学意义，提示糖代谢的变化与缬沙坦上调podocin表达及减轻肾脏损害无关。

综上所述，本研究证实缬沙坦具有保护大鼠足细胞、减轻糖尿病大鼠尿蛋白排泄的作用，这可能与其上调足细胞Podocin蛋白及Podocin mRNA的表达有关。然而，本研究只在动物实验中进行了研究，并不能完整深入地解释足细胞相关蛋白与DN蛋白尿产生之间的关联，以及缬沙坦减少蛋白尿的具体机制，有待进一步探讨。

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Huang Zhenzhen,Ren Wei, Wang Yan, et al

Protective effect of valsartan on the podocytes of diabetic rats

(Dept of Nephrology, The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230001)

Objective To observe the effects of valsartan on the podocin expression in podocytes of diabetic rats and to explore the mechanism of valsartan (an angiotensin Ⅱ receptor antagonist) on the kidney of diabetic rats. Methods Thirty-six healthy Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into normal control group and experimental group. Rats in experimental group were given streptozocin(STZ) by intrapetitoneal injection to establish animal models of diabetes, then the rat models were randomly divided into DN group and valsartan-treated group .Furthermore,after 8 weeks，glycated hemoglobin (HbA1C),urinary albumin (UALB), urinary creatinine (UCR), urinary retinol binding protein (URBP) and kidney hypertrophy index(KI) were determined to eliminate the impact of urine volume，and the parameters mentioned above were expressed as UALB /UCR(UACR),URBP/UCR( UBCR). Blood glucose was measured weekly in all groups.Podocin protein and mRNA expression in renal tissues were measured by immunohistochemistry and RT-PCR. The renal histomorphology and the structural change of podocytes were observed through optic microscope and electron microscope. Results Compared to the normal control group, BG, UACR, UBCR, HbA1C, KI were markedly higher in DN group and valsartan-treated group (P<0.01). The renal Podocin protein and mRNA expression of kidney were significantly decreased (P<0.01). The renal pathological lesions of rats in DN group were obvious. Compared to DN group, except for BG and HbA1C, UACR, UBCR, KI were significantly decreased in valsartan-treated group (P<0.01). The renal Podocin protein and mRNA expression of kidney were significantly raised (P<0.01). The pathomorphologica change in golmerulus，tubules and podocytes showed a better improvement in valsartan-treated group. Conclusion Valsartan exerts the protective effect on the podocytes in diabetic rats, and the mechanism may be achieved by the up-regulatied expression of Podocin protein and mRNA.

diabetic nephropathy; podocyte; Podocin; valsartan

时间：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.034.html

安徽省年度重点科研项目(编号：12070403059)

安徽医科大学附属省立医院1肾内科、2内分泌科、3病理科，合肥 230001

黄珍珍，女，硕士研究生；

任 伟，男，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail: renweisn@163.com

R 587.24

A

1000-1492(2016)01-0073-05

2015-09-30接收