GOLPH3、VEGF在胃癌组织中的表达及其相互关系

产世鑫，孟翔凌，吴文涌



GOLPH3、VEGF在胃癌组织中的表达及其相互关系

产世鑫，孟翔凌，吴文涌

目的 通过检测胃癌组织中高尔基体磷酸化蛋白3(GOLPH3)与血管内皮生长因子(VEGF)表达水平，探讨二者在胃癌进展中的相互关系。方法 通过免疫组织化学SP法检测55例经手术切除的胃癌组织及相应癌旁组织中GOLPH3和VEGF蛋白的表达情况。GOLPH3与VEGF在胃癌组织中表达相关性采用Pearson相关性分析。结果 GOLPH3及VEGF在胃癌组织中的阳性表达率分别为67.27%、58.18%，显著高于相应癌旁组织的18.18%、23.64%，差异有统计学意义(P<0.05)。GOLPH3、VEGF在胃癌组织中的表达与患者性别、年龄、肿瘤大小等均无显著相关性，与浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有显著相关性(P<0.05)。免疫组织化学结果显示在GOLPH3阳性表达组的胃癌组织中，VEGF阳性表达率为75.68%，明显高于GOLPH3阴性表达组的22.22%，胃癌组织中GOLPH3表达与VEGF的表达呈正相关性(r=0.508，P<0.01)。结论 GOLPH3过表达可能通过上调VEGF的表达调节胃癌血管生成，从而影响胃癌的浸润和转移。

胃癌；高尔基体磷酸化蛋白3； 血管内皮生长因子；血管生成

胃癌严重危害着人类健康和生命，其发病率占全球恶性肿瘤的第4位，因胃癌导致的肿瘤相关死亡率仅次于肺癌，在世界上排第2位[1]。尽管胃癌的手术治疗、化学治疗、放射治疗以及相关靶向治疗近些年取得了巨大进展，但是胃癌患者的预后仍然较差，这可能与胃癌的早期症状不明显、患者的就诊率低、缺乏有效便利的普查筛选手段，从而导致胃癌患者发现时大部分即为进展期有很大的关系。因此提高胃癌的早期诊断率、明确胃癌的发生发展机制以及采取相应的治疗措施对胃癌患者的诊治有着重要意义。高尔基体磷酸化蛋白3(Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3)是对高尔基体进行蛋白质组学分析时发现的，是一种从酵母到人类都高度保守的蛋白质[2]。2009年Scott et al[3]通过RNAi 基因敲除和cDNA 过表达的研究发现GOLPH3 是一个具有转化和激活能力的癌基因。Hu et al[4]研究发现胃癌组织中GOLPH3的相对表达量与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、远处转移、临床预后等相关。血管内皮生长因子(vasculoar endothelial growth factor，VEGF)是目前已知的肿瘤血管生成过程中特异性最强的促血管生长因子，其表达与胃癌的发展及预后密切相关[5]。然而针对GOLPH3与VEGF在胃癌组织内表达关系的研究国内外报道罕见。该研究通过免疫组织化学方法检测胃癌组织中GOLPH3与VEGF蛋白表达情况，探讨两者在胃癌组织中表达相关性，从而为胃癌的病理诊断及治疗提供理论依据和新思路。

1 材料与方法

1.1 病例资料 随机选取2012年1月～12月安徽医科大学第一附属医院普通外科行胃癌根治性切除手术患者胃癌组织及相应癌旁正常组织各55例。所有患者术前均未行放化疗及其他治疗，术前及术后均行组织病理学检查确诊及明确临床病理分期。男43例，女12例；年龄17～80岁(58.84±11.16)岁，其中≥60岁22例，<60岁33例；肿瘤最大直径≥5 cm者29例，<5 cm者26例；分化程度：高、中分化共22例，低分化共33例；浸润深度：侵犯浆膜者37例，未侵犯浆膜者18例；淋巴结转移情况：发生淋巴结转移39例，未发生淋巴结转移16例；临床病理分期根据2010年国际抗癌联盟(UICC)和美国癌症联合会(AJCC)共同公布的胃癌TNM分期：其中Ⅰ/Ⅱ期患者24例，Ⅲ/Ⅳ期患者31例。患者临床病理资料均完整。

1.2 主要试剂 兔抗人GOLPH3多克隆抗体购自美国Abcam公司；兔抗人VEGF单克隆抗体、生物素标记的羊抗兔IgG抗体、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)免疫组化试剂盒、二氨基联苯(DAB)显色剂等购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法 将石蜡包埋的组织行连续切片，切片厚度4 μm。所有切片经二甲苯脱蜡，梯度浓度乙醇水化，PBS冲洗3次，每次5 min，微波法行抗原修复；3%过氧化氢溶液浸泡30 min灭活组织内源性过氧化物酶，滴加非免疫性动物血清封闭，置切片于37 ℃湿箱内孵育30 min，滴加一抗，即抗GOLPH3抗体或VEGF抗体，置于4 ℃湿箱内孵育过夜；PBS冲洗3次，每次5 min，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗覆盖组织，37 ℃湿箱内孵育30 min；滴加新配置的DAB显色液，显微镜下观察最佳显色时间，自来水冲洗后行苏木精细胞核复染，0.1%盐酸酒精浸泡3 min，自来水冲洗，PBS返蓝；脱水干燥，中性树脂封片，显微镜观察结果。

1.4 染色结果判断 双盲情况下，由两名病理科医师分别对每张标本切片进行染色强度和细胞阳性率进行双评分。细胞质或细胞核染色深度：基本不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕色为3分。每例随机观察5个高倍镜(×400)视野，阳性表达细胞比例：基本不着色为0分，<10%为1分，10%～35%为2分，36%～70%为3分，>70%为4分。两者得分相乘，>4分为阳性表达，≤4分为阴性表达。

1.5 统计学处理 应用SPSS 16.0软件进行分析。GOLPH3及VEGF在胃癌组织及癌旁组织表达的关系、GOLPH3及VEGF与胃癌各临床病理特征之间的关系采用χ2检验，胃癌组织中GOLPH3表达与VEGF表达的相关分析采用Pearson相关性分析。

2 结果

2.1 胃癌组织及相应癌旁组织中GOLPH3、VEGF的表达情况 GOLPH3主要定位于细胞质，呈棕黄色颗粒(图1A1)，在胃癌组织中阳性表达率67.27%，明显高于癌旁组织的18.18%，差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF主要定位于细胞质，呈棕黄色颗粒(图1B1)，在胃癌组织中阳性表达率58.18%，明显高于癌旁组织的23.64%，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 GOLPH3与VEGF在胃癌及癌旁组织的表达情况(n)

2.2 GOLPH3、VEGF表达分别与胃癌各临床病理特征之间的关系 胃癌组织中GOLPH3、VEGF的表达与患者的性别、年龄和肿瘤大小无相关性，而与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期相关。GOLPH3、VEGF在高、中分化胃癌组织阳性表达率分别为78.79%、72.73%，明显高于低分化胃癌组织的50.00%、33.33%(P<0.05)。GOLPH3、VEGF在侵犯浆膜的胃癌组织阳性表达率分别为81.08%、70.27%，明显高于未侵犯浆膜的38.89%、33.33%(P<0.05)；GOLPH3、VEGF在有淋巴结转移的胃癌组织阳性表达率分别为84.62%、74.36%，明显高于无淋巴结转移的25.00%、18.75%(P<0.01)；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期患者GOLPH3的阳性表达率分别为37.50%、90.32%(P<0.01)，VEGF在TNM分期Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期患者的阳性表达率分别为25.00%、83.87%(P<0.01)。见表2。

2.3 GOLPH3与VEGF在胃癌组织中表达的相关性 免疫组化结果显示，在GOLPH3阳性表达组的胃癌组织中，VEGF阳性表达率为75.68%(28/37)，明显高于GOLPH3阴性表达组22.22%(4/18)。采用Pearson相关性分析显示，GOLPH3蛋白的表达与VEGF的表达呈正相关性 (r=0.508，P<0.01)。

3 讨论

研究[6]显示，GOLPH3参与执行高尔基体的蛋白质分选功能，在蛋白质的整合、受体循环以及蛋白质的糖基化过程中起重要作用。Scott et al[3]对多种实体肿瘤的5p13基因拷贝数增加进行系统性分析，并通过基因敲除实验发现，GOLPH3可能是新的致癌基因，影响肿瘤发生与发展。相关文献[7-11]报道，GOLPH3在食管癌、乳腺癌、结肠癌、神经胶质瘤及卵巢上皮细胞癌等多种恶性肿瘤中存在高表达现象。GOLPH3在恶性肿瘤中的高表达产物与相关恶性肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、预后等密切相关，也证实GOLPH3是一种致癌基因，且其表达产物在癌症的发生和进展过程中有重要作用，影响癌症患者预后。GOLPH3的高表达通过调节高尔基体蛋白质糖基化转移酶的活性及功能，使肿瘤相关蛋白的分泌异常；蛋白质的糖基化结构与肿瘤的细胞生长、黏附、迁移和侵袭都密切相关，从而导致肿瘤细胞的侵袭性增强[12-13]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是细胞内磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT)/mTOR信号通路的中心调控位点，已有研究[14]证实此信号通路对细胞的增殖、凋亡有着重要的调控作用，mTOR的异常激活参与了多种肿瘤的形成与进展。Scott et al[3]通过比较基因组杂交分析发现GOLPH3与retromer复合体的重要组成部分VPS35存在密切相关性，从而通过这种方式将GOLPH3与mTOR联系起来，推测GOLPH3通过mTOR信号通路对恶性肿瘤的生长产生影响。本研究结果显示，GOLPH3在胃癌组织中阳性表达率为67.27%，明显高于相应癌旁组织的18.18%，且GOLPH3的高表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移和TNM分期呈正相关性。

表2 GOLPH3、VEGF表达与胃癌患者各临床病理特征之间的关系

实体肿瘤无限制的侵袭性生长及转移都依赖肿瘤组织中新生血管的形成，而上调的肿瘤血管化作用以及增加的肿瘤促血管生成因子的表达已经证实与肿瘤的分级或者预后相关。VEGF是已知的肿瘤血管生成过程中特异性最强的促血管生长因子，具有明显的促血管生成作用。VEGF的表达受多因素的调控，最重要的因素是低氧。低氧可诱导低氧诱导因子1α(HIF-1α)从而上调VEGF的表达。VEGF的表达与癌症的转移、复发和预后等密切相关。本研究结果显示，VEGF在胃癌组织的阳性表达率明显高于相应癌旁组织，并且VEGF高表达的胃癌患者与其组织学分级、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期密切相关，提示VEGF的高表达可能促进胃癌的浸润和转移。

本研究结果显示GOLPH3和VEGF均与胃癌的浸润深度、淋巴结转移以及TNM分期相关，提示二者可能对胃癌的进展存在某种协同作用。同时，经相关性分析显示，胃癌组织中GOLPH3的高表达与VEGF的表达呈明显正相关性，提示胃癌组织中过表达的GOLPH3可能通过诱导上调VEGF的表达，从而促进胃癌组织中新生血管的形成，进一步影响胃癌组织的生长和发展。其机制可能是GOLPH3通过激活细胞内的PI3K/AKT/mTOR信号通路，上调HIF-1α的表达，从而促使VEGF的表达增加，使内皮细胞迁移形成新生血管增加肿瘤细胞的血供，促进肿瘤的生长[15]。

综上所述，胃癌组织中GOLPH3、VEGF的阳性表达与胃癌的进展程度均密切相关，提示二者对胃癌进展的诊断有协同作用，并且胃癌组织中过表达的GOLPH3可能上调VEGF的表达，从而促进胃癌新生血管的形成，促进胃癌的生长及发展。针对肿瘤血管生成各环节的靶向治疗是近年来肿瘤研究热点，抗血管生成药物也逐渐运用于肿瘤的临床治疗。因此，联合检测GOLPH3和VEGF的表达，可能对胃癌病理诊断、临床预后的判断及丰富胃癌的临床治疗手段有一定的指导意义。

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Relationship between the expression of GOLPH3 with VEGF expression in gastric cancer

Chan Shixin, Meng Xiangling, Wu Wenyong

(Dept of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022)

Objective To investigate the interrelationship between Golgi phosphoprotein 3(GOLPH3) expression with vasculoar endothelial growth factor(VEGF) expression in the progression of human gastric cancer by detecting the expression level of GOLPH3 and VEGF. Methods Immunohistochemistry (IHC) was used to detect the expression of GOLPH3 and VEGF in 55 cases of gastric cancerous and carcinoma-adjacent tissues. Pearson correlation analysis was used to discuss the association between GOLPH3 expression with VEGF expression. Results The immunohistochemical detection showed that the positive expression rates of GOLPH3 and VEGF were 67.27%,58.18% respectively, which were significantly higher than the positive expression rates in carcinoma-adjacent tissues (P<0.05). A statistical analysis revealed that the positive expression rate of GOLPH3 and VEGF in the gastric cancer tissues were strongly correlated with depth of invasion (P<0.05), distant metastasis (P<0.01) and TNM stages (P<0.01), whereas it did not significantly correlate with age or gender or size of tumor. Compared with the negative for the GOLPH3 expression, the VEGF expression in gastric cancer tissues positive for the GOLPH3 expression was significantly higher. The protein level of GOLPH3 expression was positively correlated with VEGF expression (r=0.508,P<0.01). Conclusion GOLPH3 overexpression may regulate gastric angiogenesis by upregulating the expression of VEGF, which affects the invasion and metastasis of gastric cancer.

gastric cancer; GOLPH3; VEGF; angiogenesis

时间：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.040.html

安徽省科技攻关项目(编号：07010300196)；安徽省高等学校博士学科点专项科研基金联合资助项目(编号：20133420120006)

安徽医科大学第一附属医院普通外科，合肥 230022

产世鑫，男，硕士研究生；

孟翔凌，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：xianglingm@medmail.com.cn

R 735.2

A

1000-1492(2016)01-0086-04

2015-10-13接收