CD90和CXCR4在肝癌中的表达及其与术后早期复发的关系

马 杰，盛治勇，许戈良，刘文斌，潘婷婷，姚启杨，李建生，马金良，荚卫东，葛勇胜，余继海，张传海，任维华，徐治军



CD90和CXCR4在肝癌中的表达及其与术后早期复发的关系

马 杰1，盛治勇2，许戈良1，刘文斌1，潘婷婷1，姚启杨1，李建生1，马金良1，荚卫东1，葛勇胜1，余继海1，张传海1，任维华1，徐治军1

目的 研究白细胞分化抗原90(CD90)和趋化因子受体4(CXCR4)在肝细胞癌组织中的表达及其与术后早期复发的关系。方法 采用免疫组化法检测140例肝癌组织标本中CD90和CXCR4蛋白的表达情况，并分析二者之间的关系及其与肝癌术后早期复发间的关系。结果 肝癌组织标本中CD90阳性表达率和CXCR4高表达率分别为80.71%和61.43%；CD90和CXCR4在肝癌中的表达均与肿瘤的大小、结节数、血管侵犯和TNM分期相关(P<0.05)，而与年龄、性别、甲胎蛋白(AFP)和肝硬化均无关；CD90与HBsAg状态和肿瘤分化程度相关(P<0.05)，而CXCR4与肿瘤包膜相关。CD90阳性表达和CXCR4高表达呈正相关性(r=0.394，P<0.001)。单因素分析结果表明，肝癌早期复发与肿瘤大小、结节数、血管侵犯、TNM分期、CD90和CXCR4蛋白的表达程度均相关(P<0.05)，而与患者的年龄、性别、HBsAg状态、AFP、肝硬化、肿瘤分化程度和包膜无关。多因素分析表明，血管侵犯、CD90蛋白阳性表达和CXCR4高表达是肝癌早期复发的独立危险因素。受试者工作特征(ROC)曲线结果提示，CD90和CXCR4能预测肝细胞癌患者的早期复发，ROC曲线下面积(AUC)分别为0.648和0.657。结论 CD90阳性表达和CXCR4高表达与肝细胞癌术后早期复发有关，并可以作为肝细胞癌早期复发的独立预后因素。

癌；肝细胞；抗原，Thy-1；趋化因子受体4；复发

肝细胞癌(简称“肝癌”)是富含血管的恶性肿瘤，且具有侵袭血管的特点[1]。目前，外科手术仍然是肝癌的一线治疗手段，但是术后高的复发率仍是影响患者长期生存的关键[2]。肝癌干细胞被认为是肝癌发生、发展、转移和复发的根源之一[3]。研究[4]表明，白细胞分化抗原90(cluster of differentiation 90, CD90)是肝癌干细胞标记分子，且其标记的肝癌细胞表现出内皮细胞的特性，并与肝癌的术后复发密切相关。趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4, CXCR4)是目前备受关注的趋化因子受体，在肝癌组织表达上调，与肝癌的进展有关[5]。该研究采用免疫组化法检测CD90和CXCR4蛋白在肝癌组织中的表达，并探讨了二者表达的关系及其与肝癌早期复发的关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料 选取2009年1月～2013年2月于安徽医科大学附属省立医院肝脏外科首次行手术切除的肝癌组织标本140例，术后均经病理检查证实，临床病历资料完整。术前均未行放疗、化疗和介入等相关辅助治疗。男107例，女33例，年龄21～78(51.7±12.4)岁。术前肝功能评分均为Child-Pugh A级。术后随访：采用门诊复查和定期电话回访进行，术后1年内每2～3个月复查1次，以后每3～6个月复查1次，每次常规行甲胎蛋白、腹部B超和胸片检查复发情况，必要时行CT、MRI或PET-CT检查，随访截止到2015年4月。

1.2 主要试剂 兔抗人CD90和CXCR4单克隆抗体购自美国Abcam公司。SP免疫组织化学染色试剂盒PV-6000、浓缩型DAB显色试剂盒、乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复液均购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.3 免疫组化检测 所有常规石蜡包埋的组织，制成4 μm厚连续切片，分别行HE和免疫组化染色，按照试剂盒说明书进行染色，最后在光学显微镜下观察显色情况。

1.4 临床病理指标 肿瘤早期复发认为是术后2年内复查发现肝内复发或肝外转移灶，非早期复发为术后2年内未出现肝内复发或肝外转移灶[6]。肿瘤直径选取肿瘤最大径；多结节认为一个结节伴肉眼可见的子灶或两个以上的结节；血管侵犯是指显微镜下血管内有肿瘤组织与血管内膜相连或充满管腔；肿瘤包膜是指在肉眼下瘤体切面肿瘤组织与周围组织有清晰的分界，肿瘤压迫周围组织形成纤维包膜，而无包膜指瘤体与周围组织界限不清；肝癌分化程度是依据埃德蒙森-斯坦纳(Edmondson-stein)分级而定；肝癌分期按2010版国际抗癌联盟/美国肿瘤联合会修订的原发性肝癌TNM分期标准。

1.5 结果判断 CD90主要定位于内皮细胞，以出现粗细不等的棕黄色细颗粒为阳性细胞。CXCR4主要定位于肿瘤细胞的质膜，以质膜出现棕黄色为阳性细胞。显微镜下双盲法阅片，高倍镜(×400)下随机选取10个视野，计数每个视野100个细胞中的阳性细胞数。CD90阳性细胞数占癌细胞数的5%以上为阳性，阳性细胞数少于癌细胞总数的5%或全部不着色为阴性[4]。CXCR4阳性细胞数占癌细胞数的20%以上为高表达，阳性细胞数少于癌细胞总数的20%为低表达[7]。

1.6 统计学处理 使用SPSS 16.0软件进行分析。计数资料采用χ2检验，相关分析采用在χ2检验的基础上计算Pearson列联系数，多因素分析采用Cox回归分析模型。

2 结果

2.1 CD90在肝癌组织中的表达 CD90 主要定位于内皮细胞，阴性细胞不着色，细胞核呈紫蓝色。见图1。140例肝癌组织中CD90阳性表达率为80.71%(113/140)。CD90的表达与肝癌临床病理指标的关系见表1。CD90阳性表达在有乙肝病史、肿瘤>5 cm、多结节、微血管受侵犯、肿瘤分化程度Ⅲ/Ⅳ级、TNM分期Ⅲ/Ⅳ期的患者高于无乙肝病史、肿瘤≤5 cm、单结节、血管未受侵犯、肿瘤分化程度Ⅰ/Ⅱ级、TNM分期Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)。CD90的表达与患者的年龄、性别、AFP水平、肝硬化有无以及包膜是否完整无关。

图1 肝癌组织CD90和CXCR4的表达 SP×400

A：CD90阳性表达；B：CXCR4高表达；C：CD90阴性表达；D：CXCR4低表达

2.2 CXCR4在肝癌组织中的表达 CXCR4主要在肝癌细胞的质膜上表达，阴性细胞不着色。见图1。140例肝癌组织中CXCR4阳性表达率为61.43% (86/140)。CXCR4的表达与肝癌临床病理指标的关系见表1。CXCR4高表达在肿瘤>5 cm、多结节、血管受侵犯、包膜不完整、TNM分期Ⅲ/Ⅳ期患者高于肿瘤≤5 cm、单结节、血管未受侵犯、包膜完整、TNM分期Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)。CXCR4的表达与患者的年龄、性别、AFP水平高低、肝硬化有无和肿瘤分化程度无关。

表1 肝癌临床病理指标与CD90和CXCR4的关系(n)

2.3 CD90和CXCR4在肝癌组织中表达的相关性 CD90与CXCR4共同表达阳性者80例，共同表达阴性者21例。113例CD90表达阳性病例中，CXCR4高表达者80例(70.80%)，27例CD90表达阴性病例中，CXCR4高表达者6例(22.22%)，经χ2检验(χ2=21.702)计算Pearson相关分析检验，CD90阳性表达与CXCR4高表达在肝癌组织中表达呈正相关性(r=0.394，P<0.001)。

2.4 CD90、CXCR4与肝癌早期复发的关系 140例肝癌患者早期复发85例，早期复发率为60.71%。CD90阳性表达者早期复发率为70.80%(80/113)，阴性表达者早期复发率18.52%(5/27)，CD90阳性表达者的早期复发率高于阴性表达者，差异有统计学意义(χ2=24.970，P<0.001)；CXCR4高表达者早期复发率为75.58%(65/86)，低表达者早期复发率37.04%(20/54)，CXCR4高表达者的早期复发率高于低表达者，差异有统计学意义(χ2=20.661，P<0.001)。见表2。

表2 肝癌患者临床病理指标与早期复发的关系(n)

单因素分析结果表明，肝癌患者的早期复发与肿瘤的大小、结节是否数个、血管是否受侵犯、TNM分期、CD90和CXCR4蛋白的表达程度均相关(P<0.05)，但与患者的年龄、性别、HBsAg状态、AFP水平、肝硬化、肿瘤分化程度和包膜是否完整无关。多因素分析显示，血管侵犯[相对危险度(relative risk，RR)=2.210，95%可信区间(confidence interval，CI)：1.506～3.245，P<0.001]、CXCR4蛋白表达(RR=1.909，95%CI：1.268～2.873，P=0.002)和CD90蛋白表达(RR=6.191，95%CI：3.124～12.269，P<0.001)是影响肝癌患者早期复发的独立危险因素。见表3。

表3 多因素分析影响肝癌患者预后的因素

2.5 CD90和CXCR4预测肝癌早期复发的能力 受试者工作特征(ROC)曲线结果显示，CD90[ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)：0.648，95%CI：0.567～0.729，P<0.001]和CXCR4(AUC=0.657，95%CI：0.578～0.736，P<0.001)能预测肝癌的早期复发。见图2。

图2 CD90和CXCR4蛋白表达预测肝癌早期复发的ROC曲线

3 讨论

目前，肝癌早期复发的机制尚不完全清楚，其主要原因在于肿瘤的自身因素。肝癌早期复发可能是由于术前肿瘤细胞已离开原发部位或手术操作(如肿瘤接触分离和间断性肝门阻断等)导致肉眼无法识别的转移。一般认为，众多的肿瘤细胞可以进入血液循环，但仅极少数具有干细胞特性的“种子”能逃离免疫监视等而幸存，最终迁移到合适的“土壤”环境而生存，导致肿瘤的治疗后复发。

CD90是一种细胞黏附分子免疫球蛋白，在肝脏的发育过程中表达于卵原细胞，但在成人肝脏中极少表达。在黑色素瘤中，CD90是微血管内皮细胞活化的标志，参与肿瘤新生血管的形成。本研究显示，CD90标记的细胞在肝癌组织中不仅具有高的阳性表达率，而且也表现出微血管内皮细胞的形态特征，这与相关研究[4]结果一致，且CD90标记的这群细胞具有肿瘤干细胞的特性已被证实。这一结果的原因可能是：一方面，CD90标记细胞具有间充质细胞的高侵袭转移能力，表现出肿瘤干细胞的特性，与肿瘤的转移复发密切相关[8]；另一方面，CD90标记的细胞具有形成新生血管能力，表现为血管内皮细胞的特性，与肿瘤的快速生长有关[9]。在肝癌中，CD90标记的细胞不仅存在于人肝癌细胞系和肝癌组织，而且也存在于循环的外周血[4]。目前，单纯的外科手术仅去除了肝癌病灶，但不能根除已进入血液循环中的肿瘤干细胞，这为肝癌的复发创造了条件。本研究显示，CD90在肝癌组织中的阳性表达与肝癌的早期复发有关，与文献[10]报道相符。

趋化因子及其受体的基本功能是趋化特定的细胞到特定的组织器官，其介导的细胞运动是肿瘤细胞定向迁移的关键环节，在肿瘤发生、侵袭和转移的过程中发挥重要作用。有研究[7]显示，CXCR4在肝癌组织中高表达，且其配体SDF-1在肝癌病灶周围组织中高表达，这为肿瘤细胞的定向迁移创造了条件，与肝癌的术后转移复发有关。本研究显示，CXCR4高表达与CD90阳性表达存在正相关。CXCR4在CD90标记的肝癌干细胞高表达[4]，最近有研究者从肝癌细胞系HepG2中分离出了少量的共表达CD90和CXCR4的肝癌细胞[11]，并证明其不仅具有肿瘤干细胞的成瘤特性，而且表现出较强的转移能力。这从一个新的角度解释了肝癌的复发，但其机制仍待于深入研究。

综上所述，CD90和CXCR4蛋白的表达与肝癌的早期复发有关，且可作为肝癌早期复发的独立预后因素。肝癌早期复发对患者的预后具有显著的影响，早发现肝癌术后复发是当前肝癌研究的重点。发现肝癌术后复发能尽可能早地采取针对性的防治措施和提高患者的总体疗效。因此，寻找预示肝癌早期复发的标志具有重要的临床意义。

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Expressions of CD90 and CXCR4 are associated with early recurrence after resection of hepatocellular carcinoma

Ma Jie1, Sheng Zhiyong2, Xu Geliang1, et al

(1Dept of Hepatic Surgery, The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University,AnhuiProvinceKeyLaboratoryofHepatopancreatobiliarySurgery,Hefei230001;2GraduateSchoolofUniversityofScienceandTechnologyofChina,Hefei230026)

Objective To study expressions of CD90 (Thy-1) and C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4) in hepatocellular carcinoma (HCC), and its relationship with early recurrence after resection of HCC. Methods A total of 140 HCC tissue specimens were used for immunohistochemical staining of CD90 and CXCR4 expressions, and the correlation between the two proteins and early recurrence was also analyzed. Results The positive expressions rate of CD90 was 80.71% and the over-expressions rate of CXCR4 was 61.43% in HCC tissue specimens. The expressions of CD90 and CXCR4 were correlated with tumor size, the number of tumor nodes, vascular invasion, and TNM stage (P<0.05). CD90 expressions was correlated with HbsAg status and the tumor differentiation degree in HCC tissue(P<0.05), and CXCR4 expressions was correlated with tumor capsule(P<0.05). The expressions of CD90 and CXCR4 were not correlated with age, sex, liver cirrhosis, and tumor capsule. There was significant positive correlation between CD90 and CXCR4 (r=0.394,P<0.001). Univariate analysis showed that the early recurrence of HCC was correlated with tumor size, the number of tumor nodes, vascular invasion, TNM stage, and the expressions of CD90 and CXCR4 (P<0.05), but not significantly correlated with age, sex, HbsAg status, AFP, liver cirrhosis, tumor differentiation degree and tumor capsule. Multivariate analysis showed that the vascular invasion and expressions of the two proteins, CD90 and CXCR4, were independent risk factors for early recurrence after resection of HCC. The results of receiver operating characteristic (ROC) curve showed that expressions of CD90 and CXCR4 might be the most important factors predicting the early recurrence of HCC after resection, and the areas under curve (AUC) were 0.648 and 0.657 respectively. Conclusion The expressionss of CD90 and CXCR4 are related to the early recurrence of HCC after resection, and both can be used as indeendent-prognosis factors for the early relapse with HCC.

carcinoma; hepatocellular; antigen; Thy-1; chemokine receptor-4; recurrence

时间：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.062.html

安徽省自然科学基金(编号：1408085MKL71)；安徽省科技平台建设计划项目(编号：1206c0805035)

1安徽医科大学附属省立医院肝脏外科、肝胆胰外科安徽省重点实室，合肥 230001

2中国科学技术大学研究生院，合肥 230026

马 杰，男，硕士研究生；

许戈良，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail: xugeliang2007@163.com

R 735.7

A

1000-1492(2016)01-0129-05

2015-10-12接收