黄瓜种子携带真菌的检测研究

， ， (天津市植物保护研究所， 天津 300381)

黄瓜种子携带真菌的检测研究

高苇，王勇，张春祥
(天津市植物保护研究所， 天津 300381)

为明确不同黄瓜品种种子携带真菌的种类及其带菌率差异，采用洗涤法和PDA平板法对12个黄瓜栽培品种进行种子外部和内部带菌检测。结果表明，供试种子外部带菌量差异较大，分离真菌的种类主要为青霉(Penicilliumspp.)、曲霉(Aspergillusspp.)、木霉(Trichodermaspp.)、根霉(Rhizopusspp.)等腐生菌及镰刀菌(Fusariumspp.)、链格孢(Alternariaspp.)、蛭孢(Cladosporiumspp.)等疑似病原真菌。种子内部寄藏真菌较少，疑似病原菌检出率显著降低，其中携带的镰刀菌分离频率最高，种壳内表皮的带菌率显著高于种胚。

黄瓜； 种子； 寄藏真菌； 带菌检测

种子是农业生产中重要的生产资料，其质量直接决定农产品产量。在种子生产、储藏和运输过程中，会与多种微生物接触，从而导致种子带菌。种子生产过程中易接触到植物病原菌，种子携带的病原菌可以作为植物病害的初侵染源，成为病害传播的主要途径[1]；种子储藏或运输时，携带的非致病菌可能对种子质量及其萌发或活力造成影响[2]。种子的安全生产、种子带菌的检测和处理是确保农作物安全生产的首要前提。

黄瓜是我国主要的蔬菜栽培品种，在其整个生长过程中会受到多种植物病原真菌的侵染，其中部分病原真菌可以在土壤和种子上越冬越夏成为下茬初侵染源。目前，生产上对病害的防治倡导选用抗病品种、生物防治、化学防治等综合防控手段，而对于其种传病原真菌的控制最有效的措施就是及时检测，及时采取种子消毒及种衣剂包衣等预防措施[3]。目前，关于黄瓜种子携带真菌种类的调查鉴定的相关报道较少，研究发现，黄瓜种子上可检测到的真菌有7～8种[4-5]，检测到的病原菌较少[6-7]。本研究参考国际种子检验规程和农作物种子健康检测方法[8]，以黄瓜种子为研究对象，对收集的天津和北京地区未包衣的黄瓜种子进行其携带真菌检测与鉴定，以期明确黄瓜种子带菌量及主要的优势真菌类型，为生产中黄瓜种子的药剂消毒处理和种衣剂的选择奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄瓜品种共12个，分别为:来自天津的黄瓜品种津春3号、津春4号、德瑞特D 19号，博新20号和德瑞特2号；来自北京的黄瓜品种中农5号、中农6号、中农8号、中农10号和中农12号；来自山东的黄瓜品种山东密刺和春秋大丰1号。

1.2 种子带菌检测

1.2.1 种子外部携带真菌的检测

将12个黄瓜品种随机各选取200粒种子，放入250 mL的三角瓶中，加入50 mL的无菌水，在25 ℃，120 r/min的摇床上充分振荡1 h。然后收集悬浮液10 mL于已灭菌的离心管中，在5 000 r/min的转速下离心20 min，去上清液，沉淀即为收集的菌体等。加入少量的无菌水使沉淀悬浮，并对其进行10倍系列的梯度稀释，每个稀释度菌悬液100μL涂布于9 cm的加有链霉素的PDA平板上，每个浓度3皿重复，置于25 ℃恒温培养箱中培养3～5 d观察平板上的菌落，根据稀释倍数和种子检测数计算种子外部携带真菌的孢子负荷量和检出真菌的比例[2]。孢子负荷量(个/粒)=每皿菌落总数/0.1 mL×稀释倍数×50 mL/200粒，分离比例(%)=某类真菌菌落数/菌落总数×100%。

1.2.2 种子内部携带真菌的检测

将各品种100粒黄瓜种子在1% NaClO溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3遍，取45粒种子在无菌的条件下将其种壳和种胚解剖开；将种胚再放置在1%NaClO溶液中浸泡3 min，用无菌水冲洗3遍。将晾干后的种壳(内壳朝下)、种胚均匀的摆放在直径为9 cm的有链霉素的PDA平板上，每皿15粒种子组织块，每个处理3次重复。置于25 ℃恒温培养箱中培养3～5 d观察平板上的菌落数。种子带菌率(%)=带菌种子数/检测种子总数×100%；某特定菌分离频率(%)=带某类菌种子数/带菌种子总数×100%。

表1 供试黄瓜种子外部分离的真菌及其分离频率

供试品种孢子负荷量分离到真菌的种类及分离频率(%)镰刀菌链格孢蛭孢木霉青霉毛霉根霉曲霉其它津春3号972a18．523．702．473．7022．2220．993．70—24．69津春4号66de5．453．641．8221．8212．7316．36—32．735．45德瑞特D19号68．4de14．04—3．5128．07—17．5412．28—24．56博新20号732b9．846．561．649．8421．3119．678．20—22．95德瑞特2号82．8d14．4915．944．35—20．2917．391．4524．641．45中农5号64．8de—9．26—9．26—20．373．7031．4829．63中农6号576c2．0814．58—16．6718．75—12．50—35．42中农8号69．6de5．176．903．4518．97—24．148．6213．7918．97中农10号62．4de3．85——19．2332．695．77—11．5426．92中农12号38．4ef3．1318．759．38—15．636．25—34．3812．50山东密刺948a15．196．332．535．0611．3925．328．861．2724．05春秋大丰1号74．4de3．2316．13—11．2922．5811．29—25．819．68

1.3 种传真菌初步鉴定

将分离到的真菌进行纯化、镜检和保存。根据真菌的培养性状和显微形态特征，参照工具书及鉴定资料进行分类鉴定[9]。

2 结果与分析

2.1 黄瓜种子外部携带真菌

通过洗涤离心法和PDA平板法检测发现，不同黄瓜种子携带的真菌具有较大的差异(表1)，山东密刺和津春3号外部带菌量最高，每粒种子携带孢子量达到900多，显著高于其它品种；博新20号种子携带孢子量为732；其它品种的种子孢子带菌量低于100，各品种间差异不显著；其中，中农12号种子带菌量最低。

从12个黄瓜品种的种子上分离到的疑似致病菌为镰刀菌(Fusariumspp.)、链格孢(Alternariaspp.)、蛭孢(Cladosporiumspp.)，其中镰刀菌的分离频率最高，津春3号、德瑞特D 19号、德瑞特2号和山东密刺上镰刀菌的分离率在15%左右；其次是链格孢菌，德瑞特2号、中农6号和春秋大丰1号上该病原的分离率在15%左右；蛭孢菌的分离率较低。镰刀菌、链格孢菌也是腐生菌的一种，所以对分离到的疑似病原菌还需进一步的致病力鉴定确定其是否为病原菌。通过分离结果发现，北京中农系列品种的带菌率显著低于天津的几个品种。另外，通过分离发现黄瓜种子表皮携带的腐生菌种类主要为木霉(Trichodermaspp.)、青霉(Penicilliumspp.)、毛霉(Mucorspp.)、根霉(Rhizopusspp.)、曲霉(Aspergillusspp.)等。不同品种黄瓜上腐生菌的主要类群差异较大。

2.2 黄瓜种子内部携带真菌

对不同黄瓜品种种子内部携带真菌进行检测鉴定，结果表明，供试品种种子内部携带真菌种类差异不显著，与种子外部携带真菌种类相似，带菌量显著低于种子表皮，种子内部种胚和内壳表皮带菌率最高的品种均为山东密刺，带菌率分别为33.33%和53.33%(表2和表3)。种胚带菌率介于0～33.33%，中农系列种子种胚带菌率均较低，其中中农6号胚上未分离到真菌。种胚上携带的真菌多为腐生菌，携带的致病菌以镰刀菌居多，津春3号、津春4号、德瑞特2号、山东密刺和春秋大丰1号上均分离到了镰刀菌；其次是链格孢，在津春3号和中农5号分离培养到了链格孢菌；在供试品种上均未分离到蛭孢菌。德瑞特D 19号、博新20号、中农6号、中农8号、中农10号和中农12号6个品种上未分离到致病菌。种子内部种壳内表皮带菌率明显高于种胚。德瑞特D 19号、博新20号、中农6号和中农8号4个品种种壳上未分离到致病菌。

表2 供试黄瓜种子种胚寄藏疑似病原真菌及其分离频率

供试品种种子带菌率(%)分离频率(%)镰刀菌链格孢蛭孢其它津春3号26．678．3316．67—75．00津春4号17．7825．00——75．00德瑞特D19号22．22———100．00博新20号13．33———100．00德瑞特2号24．4427．27——72．73中农5号11．11—40．00—60．00中农6号0．00————中农8号8．89———100．00中农10号6．67———100．00中农12号11．11———100．00山东密刺33．3326．67——73．33春秋大丰1号15．5614．29——85．71

表3 供试黄瓜种子种壳内部寄藏疑似病原真菌及其分离频率

供试品种种子带菌率(%)分离频率(%)镰刀菌链格孢蛭孢其它津春3号42．2215．7915．79—68．42津春4号24．449．09——90．91德瑞特D19号22．22———100．00博新20号28．89———84．62德瑞特2号26．6716．67—8．3375．00中农5号22．22—20．00—80．00中农6号8．89———100．00中农8号22．22———100．00中农10号17．78—37．50—62．50中农12号15．5614．29——85．71山东密刺53．3325．008．33—66．67春秋大丰1号26．6725．00——75．00

3 结论与讨论

本研究对天津、北京和山东地区生产的黄瓜品种采用洗涤离心和PDA平板培养的方法对种子表皮、种子内壳和种胚上携带的真菌进行检测和鉴定。试验结果表明，不同黄瓜品种上携带的真菌主要包括疑似种传病原菌和部分腐生菌。疑似病原菌为镰刀菌、链格孢和蛭孢菌，其中镰刀菌是一种主要的种传根部病原菌，链格孢和蛭孢菌可以引起黄瓜叶片发生黑斑病和黑星病，本研究从供试品种上均分离到了这3种病原菌，但由于其也可能是一种腐生菌，所以对于分离到的疑似病原菌的致病性仍需进一步的接种试验证明。通过分离培养试验发现，黄瓜种子上携带的真菌种类与西瓜、玉米、水稻等其他作物具有一定的相似性[2,10-13]，种子表皮携带的真菌多为腐生菌，分离到的病原菌较少。种子内部携带的真菌数量显著低于种子表皮，其中种胚上携带的真菌数量最低。通过分离培养试验发现德瑞特D 19号、博新20号、中农6号和中农8号4个品种仅分离到了腐生菌，未分离到致病菌。对于种胚和种子内壳上分离到疑似病原菌的品种，其病原菌的致病性有待进一步的研究探讨，以衡量其生产使用的安全性。

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Testing of Seed-Associated Fungi of Cucumber Seed

GAOWei，WANGYong，ZHANGChunxiang

2016-04-28

天津市自然科学基金青年项目“多主棒孢毒素cassiicolin对黄瓜致病机制的研究”(编号：13 JCQNJC 14900)。

高 苇(1982—)，女，辽宁瓦房店市人；助理研究员，博士，主要从事植物病原真菌的检测和防治方面的研究；E-mail:gaowei5277@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.09.091

S 642.2； S 432.1

A

1001-4705(2016)09-0091-03