鲟鱼骨中硫酸软骨素的提取及测定

李圣男，蔡大川，郑家概，张 飞，付 强，陈嘉勋

(中国广州分析测试中心，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东 广州 510070)



鲟鱼骨中硫酸软骨素的提取及测定

李圣男，蔡大川，郑家概，张 飞，付 强，陈嘉勋

(中国广州分析测试中心，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东 广州 510070)

建立了以鲟鱼软骨为原料，超声波辅助提取硫酸软骨素的方法，研究了超声时间，碱浓度，料液比对提取的影响，并用高效液相色谱测定。结果表明，最佳提取条件为：超声时间30 min，碱浓度2.0%，料液比1：8。 硫酸软骨素在10.0～1000 mg/L线性良好，检出限为2.0 mg/kg，回收率为92%～101%，RSD为1.07%。该方法操作简便，准确可靠，重复性好，适于鲟鱼软骨中硫酸软骨素的提取和测定。

鲟鱼；硫酸软骨素；超声提取；高效液相色谱法

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate,简称CS)是一类重要的天然酸性黏多糖, 广泛存在于动物软骨组织中，是动物蛋白聚糖的代表物质[1-2]。因其具有消炎、抗肿瘤、降血脂和抗粥样斑块形成等药理作用，效果良好且毒副作用小，已应用于医药、食品、生物材料及化妆品等领域[3-4]。 目前市场上的产品多为鲨鱼硫酸软骨素, 但由于鲨鱼资源有限, 限制了它的开发应用。 鲟鱼，也称鲟龙，和鲨鱼同样是地球上最古老和最原始的软骨鱼种，个体较大、寿命较长， 而且我国资源丰富，可作为天然优质硫酸软骨素的提取原料。然而有关鲟鱼中的硫酸软骨素，优化提取并且用高效液相色谱测定的研究尚不多，本文以鲟鱼软骨为原料，采用超声波辅助碱提取，反相高效液相色谱测定，为进一步研究鲟鱼硫酸软骨素提供参考依据[5-8]。

1 实 验

1.1 实验仪器

Agilent1260 高效液相色谱仪、二极管阵列检测器(DAD)， 美国安捷伦；FB15067型超声波清洗器，美国fisherbrand；BSA224S 电子天平，北京赛多利斯科学仪器公司。

1.2 试剂与材料

鲟鱼，购于当地市场；硫酸软骨素标准品，中国药品生物制品检定所；甲醇(色谱纯)，美国Merck公司；乙腈(色谱纯)，美国Fisher公司；实验用水为去离子水；其余试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂。

1.3 实验方法

本文采用超声波辅助碱提取法，从提取时间、碱浓度、料液比等几方面影响因素进行优化，用高效液相色谱进行测定。

1.3.1 标准溶液配制

准确称取硫酸软骨素对照品适量于100 mL容量瓶中，用10%乙腈水溶液配制成浓度为1.00 mg/mL的标准储备溶液，再将储备溶液稀释成10.0、20.0、50.0、100、250、500 μg/mL的系列工作溶液。

1.3.2 软骨预处理

将鲟鱼软骨组织置于90 ℃ 水浴30 min，再除去肌肉脂肪等杂质，清洗干净后切碎，用50 ℃烘箱烘干，粉碎备用。

1.3.3 超声提取时间优化

称取适量鲟鱼骨粉五份，按一定料液比加入10%乙腈水溶液，考察超声时间分别为10, 20, 30，60，120 min 时的CS含量，得最佳提取时间。

1.3.4 碱浓度优化

称取适量鲟鱼骨粉五份，按一定料液比加入10%乙腈水溶液，考察分别加入0.1%，0.5%，1%，2%，5% 的氢氧化钠，超声相同时间后的CS含量，得最佳碱浓度。

1.3.5 料液比优化

称取适量鲟鱼骨粉五份，按 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9的料液比加入10%乙腈水溶液，考察加入相同浓度碱，超声相同时间的CS含量，得最佳料液比。

1.3.6 色谱条件

色谱柱：月旭C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈/戊烷磺酸钠溶液=10/90; 流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温35 ℃；检测波长：195 nm。

2 结果与讨论

2.1 超声提取时间对CS含量的影响

表1 超声提取时间对CS含量的影响

从表1可知，超声时间在0～30 min范围内时，CS含量随时间延长而增加，30 min是达到峰值,可能是随着超声处理时间的延长，超声的空化作用和机械震荡作用等，使得细胞破碎越来越完全，CS含量也随之增大。而时间继续延长，CS含量变化并不明显，考虑到成本和效率等因素，确定最佳超声提取时间为30 min。

2.2 碱浓度对CS含量的影响

表2 碱浓度对CS含量的影响

由表2可知，在一定范围内，CS含量随NaOH浓度升高而增加，当NaOH浓度达到2.0%后，CS含量的增加趋势放缓。可能是CS在组织中多以蛋白多糖的形式存在，而碱性条件可以使糖蛋白发生水解，破坏多糖链与蛋白质之间的共价键，将硫酸软骨素以游离态释放出来。但实验中也发现碱浓度越高，导致目标物的杂志干扰越严重，考虑到后续纯化的复杂性，本实验中NaOH最适浓度定为2.0%。

2.3 料液比对CS含量的影响

表3 料液比对CS含量的影响

由表3可知，当料液比为1:8之前，随着料液比的增大，CS含量有明显增加，而之后CS含量并没有显著提高。可能溶剂中提取物浓度较低，与鲟鱼骨中形成浓度差，扩撒推动力大。随着料液比的增大，增加了溶质即CS的扩散速度，但增大到一定程度，这种作用相对变弱，增加也就不明显。综合考虑，确定最佳料液比为1:8。

2.4 实际样品含量测定

本文按照上述色谱条件，将硫酸软骨素标准溶液进行上机分析，如图1所示，峰形对称度高，峰底宽度小。取鲟鱼骨粉样品，按照上述最优化条件提取后上机测定，色谱图见图2，可见基线平稳，峰形良好，与其它杂质基线分离。

图1 标准溶液的液相色谱图

图2 鲟鱼样品的液相色谱图

2.5 线性范围

使用1.3.1配制的标准工作溶液按上述优化的方法进行测定，以硫酸软骨素色谱峰的面积为纵坐标(Y)，标准质量浓度(X)为横坐标，求得线性方程为Y=10.925X-14.701，r2=0.9998，结果表明，在10.0～1000 mg/L范围内，线性良好。硫酸软骨素检出限为2.0 mg/kg(信噪比S/N=3)。

2.6 精密度试验

选取浓度为250.0 μg/mL的标准使用液，进样量10 μL，连续进样7次，求得相对标准偏差RSD为 0.28%。结果表明仪器的精密度良好。

2.7 重复性实验

取同一批样品6份，按照上述优化的条件进行测定，计算其相对标准偏差RSD为1.07%。结果表明该方法重复性较好。

2.8 稳定性试验

选取浓度为250.0 μg/mL的标准使用液，在室温分别放置0、2、4、6、8、12、24 h后进样10 μL，测量其峰面积，求得相对标准偏差RSD为1.76%，表明标准使用液在24 h内稳定。

2.9 加标回收率

精密称取适量鲟鱼骨样品6份，并且加入一定量的硫酸软骨素对照品溶液，按照上述优化条件处理，测定硫酸软骨素含量，求得加标回收率为92%～101%。方法的准确度良好，可满足测定要求。

3 结 论

本文采用超声波碱提法，结合高效液相色谱，建立了完整的从鲟鱼软骨中提取硫酸软骨素和准确测定的方法，并对提取条件进行了优化。该方法简便准确，灵敏度较高，重复性良好，因此鲟鱼软骨可作为重要的硫酸软骨素资源，也可为进一步研究提供理论依据。

[1] 于海州,范慧红,宋玉娟,等.硫酸软骨素含量测定方法研究进展[J].中国生化药物杂志,2011, 32(2):160-162.

[2] 李鑫,姚开,贾冬英,等.硫酸软骨的提取和纯化分离技术[J].天然产物研究与开发,2004,16(6):597-600.

[3] 郝淑贤,石红,杨贤庆,等.鲟鱼软骨成分分析及营养评价[J].食品与发酵工业,2006,32(9):72-74.

[4] 尹孝萍,党斌.牦牛气管中硫酸软骨素提取工艺研究[J].食品工业,2015,36(9):88-91.

[5] 宋居易,桂萌,马长伟,等. 鲟鱼硫酸软骨素制备工艺优化[J].中国农业大学学报,2014,19(5):116-123.

[6] 郑江,关瑞章,黄世玉.鲟鱼和鲨鱼硫酸软骨素红外光谱特性的比较研究[J].光谱学与光谱分析,2008,28(1):106-109.

[7] 鲍伦军,杨建成,何振华,等.鱼翅中硫酸软骨素的酶解-高效液相色谱法测定[J].分析测试学报,2002,21(5):59-61.

[8] Li S N, Tian M L, Row K H. Effect of mobile phase additives on the resolution of four bioactive compounds by RP-HPLC[J].Int. J. Mol. Sci,2010,11:2229-2240.

Extraction and Determination of Chondroitin Sulfate from Sturgeon*

LISheng-nan,CAIDa-chuan,ZHENGJia-gai,ZHANGFei,FUQiang,CHENJia-xun

(China National Analytical Center Guangzhou, Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals, Guangdong Guangzhou 510070, China)

The method of extraction of chondroitin sulfate from sturgeon by ultrasonic was developed. The effects of ultrasonic treatment time, the concentration of NaOH and material liquid ratio on chondroitin sulfate content were studied, and then detected by high performance liquid chromatography. The results showed that the optimum conditions were as follows: the ultrasonic treatment time was 30 min, the concentration of NaOH was 2.0% and the material liquid ratio was 1:8. The calibration curve of chondroitin sulfate was good in the range of 10.0～1000 mg/L. The determination of limit was 2.0 mg/kg. The average recoveries were in the range of 92%～101% and RSD was 1.07%. This method is simple, accurate and reliable, it can be used for extraction and determination of chondroitin sulfate from sturgeon.

sturgeon; chondroitin sulfate; ultrasonic extraction; high-performance liquid chromatography (HPLC)

广东省水产专业镇产品安全与质量控制创新发展联盟建设(No: 2015B090906023)；海产品辨别与品质检测技术研究(No: 2013B020501005)；动物源性食品安全监测技术研究和公共服务平台(No: 粤科规财字【2014】208号)。 第一作者：李圣男 (1985-)，男，硕士，主要从事高效液相色谱法在食品检测中的应用。

O657.7+2

B

1001-9677(2016)021-0111-03