妊娠期大气细颗粒物暴露对新生小鼠肝脏发育的影响

巩艳，李文燕，郑昕蕊，李雪雪，张红霞，于丽*，江洪

（1潍坊医学院临床医学院，潍坊 261053；2潍坊市人民医院妇产科，潍坊 261041）

妊娠期大气细颗粒物暴露对新生小鼠肝脏发育的影响

巩艳1，李文燕1，郑昕蕊1，李雪雪1，张红霞1，于丽1*，江洪2*

（1潍坊医学院临床医学院，潍坊 261053；2潍坊市人民医院妇产科，潍坊 261041）

目的 建立小鼠妊娠期大气细颗粒物（fine particulate matter，AD≤2.5um，PM2.5）暴露模型，探讨妊娠期PM2.5暴露对新生小鼠肝脏发育的影响。方法 孕鼠随机分为对照组、PM2.5低剂量组、PM2.5中剂量组，利用气管滴注方法分别向PM2.5低、中剂量组注入浓度为0.2592μg／μl、1.56695μg／μl的30μl PM2.5混悬液，对照组注入相同体积磷酸盐缓冲液。孕期间断滴注7次。HE染色观察新生小鼠肝脏的组织结构变化，免疫组织化学技术和Western blot技术观察新生小鼠肝脏PCNA和caspase-3蛋白的表达情况。结果 PM2.5中剂量组新生小鼠肝脏中可见明显病理学改变，肝细胞水肿，明显脂肪变性。随着滴注剂量的增加，免疫组织化学技术显示肝脏PCNA阳性细胞数逐渐减少，caspase-3阳性细胞数逐渐增多；Western blot技术显示PM2.5暴露后新生小鼠肝脏PCNA蛋白表达量有不同程度降低，caspase-3蛋白表达量升高。结论 妊娠期PM2.5暴露可通过抑制肝细胞的增殖和促进其凋亡，从而影响新生小鼠肝脏的发育，并产生病理损害。

妊娠期；PM2.5；新生小鼠；肝脏；PCNA；caspase-3

近年来，随着雾霾天气越来越严重，大气污染成为备受全球关注的环境问题，其中PM2.5是影响大气环境质量和人体健康的主要危害因素之一［1］。PM2.5也称细颗粒物，是指空气动力学直径小于或等于2.5μm的颗粒物，因其颗粒物的粒径较小，表面积大，易滞留在体内，因此对人体的危害更大［2-3］。大气中PM2.5主要来源于人类活动、污染源的排放以及气象条件。前期实验已经证实妊娠期PM2.5暴露损伤孕鼠多种器官并抑制妊娠及胎儿生长发育［4］。肝脏对来自体内和体外的许多非营养性物质如各种药物、毒物以及体内某些代谢产物，具有生物转化作用。当肝脏受到体外毒物及其他有害物质的侵入时，其结构可能会受到不同程度的损害。因此，本研究选取备受关注大气细颗粒物（PM2.5）和新生小鼠肝脏作为研究对象，通过建立PM2.5暴露的孕鼠动物模型，观察新生小鼠肝脏病理结构及肝脏组织PCNA和caspase-3蛋白的表达变化，探讨妊娠期PM2.5暴露对新生小鼠肝脏发育的影响，从而为研究PM2.5在妊娠期暴露对人类胎儿肝脏发育的影响提供实验依据。

材料与方法

1 PM2．5标本的采样和处理［4］

采用大气颗粒物采样器，收集2012年12月～2013年3月采暖季某地级市城区大气PM2.5。将载有颗粒物的滤膜裁剪为小块，浸入去离子水中，低温超声振荡30 min4次，洗脱细颗粒物，收集滤液，真空冷冻干燥，收集PM2.5并于-20℃保存。滴注时，以PBS为溶剂配制成需要的浓度，超声振荡混匀灭菌。

2 妊娠期PM2．5暴露小鼠模型的制备

昆明雌鼠30只，雄鼠15只，体重30～38g，由青岛动物中心提供。小鼠适应一周后，按雌雄2：1比例合笼，于每日早8点检查雌鼠阴道，有精子者定为妊娠第1d，并随机分为3组，每组10只。在确认雌鼠妊娠当天直至妊娠终止，雌鼠经4%水合氯醛麻醉后，按照气管滴注的方法，实验组每3d给予一次PM2.5混悬液30μl，浓度分别为：中剂量组1. 56695μg／μl，低剂量组0.2592μg／μl，对照组每3d给予一次PBS 30μl。妊娠期共滴注7次。普通饲料喂养，自由饮水。实验合理使用实验动物进行研究，并经过动物伦理委员会批准。

3 新生小鼠肝脏病理学观察

新生小鼠出生当天，每组随机选取6只，雌雄各半，剖腹取出肝脏组织，4%多聚甲醛固定保存，制备石蜡切片，切片厚度为4μm，烤片，脱蜡入水，苏木素-伊红染色，脱水透明，中性树胶封片。

4 PCNA和caspase-3蛋白表达的Western blot检测

分离新生小鼠肝脏组织，将肝脏组织置于冰上，4℃12000r／min离心15min，提取上清，用BCA法测定蛋白浓度。将20μg蛋白样品进行10%SDS-PADE电泳，恒压80V将蛋白转自PVDF膜（Millipore），转膜时间100min。将PVDF膜置于5%脱脂奶粉室温摇床封闭抗原2h后放入TBST稀释小鼠抗PCNA（1：1000，Abcam）或兔抗cleaved-caspase-3（（1：800，Abcam）中4℃冰箱孵育过夜，用TBST稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG（1：2000）或羊抗兔IgG（1：2000）室温摇床2h，ECL发光液（Thermo）反应3min，在暗室中进行曝光显影定影。小鼠抗β-actin（1：6000，北京中杉金桥生物技术公司）检测内参蛋白，检测方法相同。利用凝胶成像仪分析软件进行光密度测定分析。每组取3张Western blot显影胶片置于扫描仪扫描，用Quntity one图像分析软件测定Western blot显示条带的光密度值，进行目的条带与内参条带光密度比值计算、分析。

5 PCNA、caspase-3表达的免疫组织化学检测

采用S-P免疫组织化学二步染色法检测肝组织PCNA、caspase-3蛋白的表达。每组随机选取6只新生小鼠肝脏石蜡切片，经脱蜡入水、热抗原修复、3%过氧化氢封闭30min、10%羊血清封闭30min，分别加入PCNA（1：10000）、cleavd-caspase-3（1：1000）抗体4℃过夜；羊抗小鼠IgG（1：2000）或羊抗兔IgG（1：2000）二抗孵育、DAB显色、脱水透明、中性树胶封片，每组共得出12张图像。用图像分析软件分别对采集图像的PCNA、caspase-3阳性细胞进行计数得出累积光密度值（IOD），并进行统计学分析。

6 统计学分析

使用SPSS22．0软件对数据进行分析，实验数据采用均数±标准差（±s）表示，计量资料两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

结　果

1 妊娠期PM2．5暴露引起新生小鼠肝脏损害

HE染色结果显示，PM2.5中剂量组新生小鼠肝脏肝细胞排列紊乱，胞浆疏松化，可见明显病理学改变，包括大多数肝细胞水肿，轻度脂肪变，及少量炎细胞浸润；PM2.5低剂量组仅可见轻度肝细胞水肿（图1）。

图1　妊娠期PM2.5暴露后新生小鼠肝脏组织形态学改变（HE染色）。箭头示肝细胞脂肪变性；比例尺：A1，B1 and C1：50μm；A2，B2 and C2：20μmFig.1　Histomorphological chances of newborn mouse liver after gestational exposure to PM2.5（HE staining）.Arrows indicate fatty degeneration of liver cells；scale bar：50μm in A1，B1 and C1；20μm in A2，B2 and C2.

2 妊娠期PM2．5暴露降低新生小鼠肝脏PCNA水平

Western blot检测显示，PCNA在各组新生小鼠肝脏组织提取的总蛋白中均有表达，随PM2.5滴注剂量的增加，PCNA蛋白的表达量有不同程度降低（图2A），以中剂量组更为明显。

免疫组织化学染色显示，PCNA蛋白表达部位主要在细胞核，呈黄色或棕黄色颗粒，表示肝细胞对PCNA的表达程度强弱不等（图2B1）。对照组肝脏组织PCNA阳性细胞数多，染色较深，多数为肝细胞；与对照组相比，PM2.5低剂量组PCNA阳性细胞数量略有减少，而PM2.5中剂量组PCNA阳性细胞数量减少明显，且染色浅，表达程度较低。图像分析结果显示，与对照组比较，PM2.5中剂量组新生小鼠肝脏PCNA阳性细胞数明显减少，累积光密度值降低；而PM2.5低剂量组与对照组比较，新生小鼠肝脏PCNA阳性细胞数略有减少，累积光密度值略有降低（图2B2）。

图2　妊娠期PM2.5暴露后新生小鼠肝脏PCNA蛋白的表达。A1，新生小鼠肝脏PCNA蛋白表达水平的Western blot检测；A2，新生小鼠肝脏PCNA蛋白表达水平Western blot检测的统计学分析；B1，新生小鼠肝脏PCNA蛋白表达的代表性免疫组织化学检测（a，对照组；b，PM2.5低剂量组；c，PM2.5中剂量组）；比例尺，20μm；B2，新生小鼠肝脏PCNA蛋白表达免疫组织化学检测的统计学分析；*，与对照组比较，0.01＜P＜0.05；**，与对照组比较，P＜0.01Fig.2　Expression of PCNA protein in newborn mouse liver after gestational exposure to PM2.5.A1，Western blot detection of PCNA level in newborn mouse liver；A2，statistical analysis of the PCNA level detected by Western blot in newborn mouse liver；B1，representative immunohistochemical detection of PCNA expression in newborn mouse liver（a，the control group；b，PM2.5low dose group；c，PM2.5medium dose group）；scale bar，20μm；B2，statistical analysis of PCNA expression detected by immunohistochemistry in newborn mouse liver；*，0.01＜P＜0.05，compared with the control group；**，P＜0.01，compared with the control group

3 妊娠期PM2．5暴露后新生小鼠肝脏cleavedcaspase-3蛋白表达升高

Western blot检测显示，cleaved-caspase-3在各组新生小鼠肝脏组织提取的总蛋白中均有表达，PM2.5暴露后cleaved-caspase-3水平明显增加，中剂量滴注动物增加更明显（图3A）。

免疫组织化学染色显示，cleaved-caspase-3表达部位在细胞浆及细胞核周，呈棕黄色或黄色颗粒。对照组中，cleaved-caspase-3阳性的肝细胞很少，仅肝血窦区可见少量cleaved-caspase-3阳性细胞，且染色较浅，呈低度表达；PM2.5低剂量组cleaved-caspase-3阳性的肝细胞也很少，但肝血窦区可见较多cleaved-caspase-3阳性细胞；PM2.5中剂量组cleavedcaspase-3阳性的肝细胞增多，且PM2.5中剂量组肝血窦区可见较多cleaved-caspase-3阳性细胞且染色较深，表达程度高（图3B1）。图像分析结果显示，与对照组比较，PM2.5低剂量组新生小鼠肝脏组织cleaved-Caspase-3阳性细胞数增多，累积光密度值升高，且随着滴注剂量的增加，新生小鼠肝脏组织cleaved-Caspase-3阳性细胞数增多明显，累积光密度值升高也明显（图3B2）。

图3　妊娠期PM2.5暴露后新生小鼠肝脏　cleaved-caspase-3蛋白的表达。A1，新生小鼠肝脏cleaved-caspase-3蛋白表达水平的　Western blot检测；A2，新生小鼠肝脏cleaved-caspase-3蛋白表达水平Western blot检测的统计学分析；B1，新生小鼠肝脏cleaved-caspase-3蛋白表达的代表性免疫组织化学检测（a，对照组；b，PM2.5低剂量组；c，PM2.5中剂量组）；比例尺，20μm；B2，新生小鼠肝脏　cleavedcaspase-3蛋白表达免疫组织化学检测的统计学分析；*，与对照组比较，0.01＜P＜0.05；**，与对照组比较，P＜0.01Fig.3　Expressions of cleaved-caspase-3 protein in newborn mouse liver after gestational exposure to PM2.5.A1，Western blot detection of cleaved-caspase-3 level in newborn mouse liver；A2，statistical analysis of the cleaved-caspase-3 level detected by Western blot in newborn mouse liver；B1，representative immunohistochemical detection of cleaved-caspase-3 expression in newborn mouse liver（a，the control group；b，PM2.5low dose group；c，PM2.5medium dose group）scale bar，20μm；B2，statistical analysis of cleaved-caspase-3 expression detected by immunohistochemistry in newborn mouse liver；*，0.01＜P＜0.05，compared with the control group；**，P＜0.01，compared with the control group

讨 论

大气细颗粒物（PM2.5）是空气中一种非均质的混合物，是普遍存在的环境污染物，其化学组成和颗粒物的大小不同取决于其来源及化学转变形式。PM2.5组成成分复杂，可吸附大量重金属元素和有毒有机污染物，通过支气管和肺泡进入血液循环并经胎盘直接影响孕妇和新生儿。中国国家环境保护部发布了新环境空气质量标准（GB 3095-2012），课题设计的低剂量组按照其规定的PM2.5日均剂量的上限值计算，中剂量组依据监测到的最大日均值计算［4］。前期实验已经证实妊娠期PM2.5暴露损伤孕鼠多种器官并抑制妊娠及胎儿生长发育［4-5］。大量研究还发现，大气细颗粒物能够引起遗传性DNA损伤，即生殖细胞的DNA损伤可遗传至下一代［6］。妊娠期高浓度PM2.5暴露可以影响婴儿的生长发育，对新生儿产生不良影响［7-8］。

有文献证实，成年大鼠气管灌注PM2.5混悬液后，重金属铅、锰在肝内的沉积显著升高。高浓度的PM2.5刺激肝脏失代偿，肝脏解毒功能受损［9］；PM2.5成分中含有的重金属及有毒有机污染物，可通过胎盘屏障，直接损伤胎盘滋养细胞，引起胎盘的炎症反应和氧化损伤，进一步影响母体与胎儿的物质交换和转运，造成胎儿的营养供应不足，阻碍胎儿的生长发育［10］。本实验发现，PM2.5中剂量组新生小鼠肝脏可见大量肝细胞水肿，轻度脂肪变的病理学改变，说明PM2.5作为体外毒物通过肝生物转化和代谢导致新生小鼠肝脏结构改变。可见PM2.5成分可穿过母体胎盘屏障，对新生小鼠肝脏造成病理学改变，进而引发炎性损伤。

增殖细胞核抗原（PCNA）是一种核内合成所必需的、无种属和组织特异性、广泛存在于增殖活性细胞中的细胞周期相关蛋白，是DNA聚合酶的辅因子，其阳性程度，可以直接反应DNA复制的活跃程度［11］。通过研究PCNA可以了解肝细胞增殖状态，其含量越高，细胞增殖越活跃。新生鼠肝细胞处于增殖非常活跃的时期，当受到体外毒物的浸入时，其增殖活性可能被抑制。研究显示，PM2.5中剂量组新生小鼠肝组织PCNA蛋白表达水平明显低于对照组。说明妊娠期PM2.5暴露可以抑制肝细胞增殖，抑制新生小鼠肝细胞PCNA蛋白的表达，进一步说明妊娠期PM2.5暴露可致新生小鼠肝细胞损伤，从而影响新生小鼠肝脏发育。

Caspase家族蛋白酶的激活在细胞凋亡过程中起着重要的作用，而cleaved-caspase-3是最重要的凋亡执行者，因此cleaved-caspase-3是应用较多的细胞凋亡水平检测指标［12］。通过检测cleaved-caspase-3可以了解肝细胞凋亡状态，其水平越高，细胞凋亡越严重。有研究发现，当肝细胞受到病理损伤时，可抑制细胞增殖的活性和促进细胞凋亡的发生［13］。本研究显示，PM2.5低剂量组及PM2.5中剂量组新生小鼠肝组织cleaved-caspas-3水平明显高于对照组，说明妊娠期PM2.5暴露可激活新生小鼠肝细胞caspase-3，以诱发肝细胞凋亡，进一步说明妊娠期PM2.5暴露可致新生小鼠肝细胞损伤，从而影响新生小鼠肝脏发育。

本研究采取气管滴注大气细颗粒物的暴露方式，较好地模仿了人群大气细颗粒物吸入量，从一定程度上为评估大气细颗粒物对新生儿健康危害提供了实验依据。研究结果表明：母鼠妊娠期PM2.5暴露可引起其新生小鼠肝脏结构改变、PCNA阳性表达减少、cleaved-caspas-3阳性表达升高，表明一定水平的大气细颗粒物可以对新生小鼠肝脏发育产生影响，可为全面评价PM2.5对机体的毒性、防治环境污染物毒性作用提供理论基础，具有一定的科学价值和现实意义，其相关机制还有待于进一步研究。

[1]周学华,王哲,郝明途,等.济南市春季大气颗粒物污染研究.环境科学学报,2008,28(4):755-763.

[2]Squadrito GL,Cueto R,Dellinger B,et al.Quinoid redox cycling as a mechanism for sustained free radical gen-eration by inhaled airborne particulate matter,Free Radic.Biol Med,2001,31(9):1132-1138.

[3]Vinitketkumnuen U,Kalayanamitra K,Chewonarin T,et a1.Particulate matter,PM10＆PM2.5 levels,and air borne mutagenicity in Chiang Mai,Thailand,Mutat.Res, 2002,519(1-2):121-131.

[4]赵会,谭金峰,刘德文,等.妊娠期大气细颗粒物暴露损伤孕鼠多种器官并抑制妊娠及胎儿发育.中国组织化学与细胞化学杂志,2016,25(1):42-48.

[5]严超,曹希宁,沈炼桔.汽车尾气来源PM2.5长期暴露导致大鼠多器官损害.重庆医科大学学报,2015,40(6): 328-333.

[6]Samet JM,DeMarini DM,Malling HV,et al.Do airborne particles induce heritable mutations?Science,2004,304 (5673):971-972.

[7]Lawrence MS,Melinda D,Alice DS,et al.Growth of infants’length,weight,head and an TI circumferences in relation to low levels of blood lead measured serially.Am J Hum Biol,2009,21(2):180-187.

[8]Jedrychowski W,Perera F,Mrozek-Budzyn D,et al.Gender differences in fetal growth of newborns exposed prenatally to airborne fine particulate matter.Environ Res,2009, 109(4):447-456.

[9]Li QZ,Liu H,Alattar M,et al.The preferential accumulation of heavy metals in different tissues following frequent respiratory exposureto PM2.5 in rats.Sci Rep,2015, 5:16936.

[10]BrauerM,Lenear C,Tamburic L,et al.A cohort study of traffic-related air pollution impacts on birth outcomes.Environ Health Perspect,2008,116(5):680-686.

[11]Williams GJ,Johnson K,Rudolf J,et al.Structure of the heterotrimeric PCNA from Sulfolobussolfataricus.Acta Crystallogragh Sect F Struct Biol Cryst Commun,2006,10(62): 944-948.

[12]Wang GH,Lan R,Zhen X,et al.An-Gong-Niu-Huang-Wan protects against cerebral ischemia induced apoptosis inrats:Up-regulation of Bcl-2 and down-regulation of Bax andcaspase-3.JEthnopharmacol,2014,154(1): 156-162.

［13］孙健平，崔静.萘乙酸对小鼠肝细胞增殖与凋亡的影响.毒理学杂志，2015，29（3）：211-214.

Effects of gestational exposure to atmospheric fine particulate matter on liver development of newborn mice

Gong Yan1,Li Wenyan1,Zheng Xinrui1,Li Xuexue1,Zhang Hongxia1,Yu Li1*,Jiang Hong2*
（1Clinical medicine college，Weifang Medical University，Weifang 261053，China；2Department of Gynecology and Obstetrics，Weifang People＇s Hospital，Weifang 261041，China）

Objective To establish mice model of exposure to atmospheric fine particles matter(AD≤2.5um,PM2.5)during gestation to investigate the effects of PM2.5on the development of liver in newborns.Methods Pregnant mice were randomly divided into three groups:the control group,PM2.5low dose group,and PM2.5medium dose group.The tracheal instillation method was used to inject the experimental groups of mice with 30μl PM2.5suspension of different doses(low dose:0.2592 μg／μl,medium dose: 1.56695 μg／μl)respectively,and the control group with phosphate buffer saline of the same volume.The instillation was intermittently performed for a total of seven times during pregnancy.The liver structural change was observed with HE staining in newborn mouse, and the expressions of PCNA and caspase-3 proteins were detected by immunohistochemistry and Western blot.Results Compared with the control group,obvious pathological changes were observed in the livers of newborn mice in the medium dose group of PM2.5exposure,including liver cell edema and significant fatty degeneration.Immunochemistry results showed that the number of PCNA positive liver cells decreased with the increase of instilled PM2.5dose,while that of caspase-3 positive cells increased.Western blot showed that the expression of PCNA protein decreased while caspase-3 increased to varying degrees in the newborn mouse liver after gestational PM2.5exposure.Conclusion PM2.5exposure during gestation can affect newborn mouse liver development and cause pathological lesion through the inhibition of liver cell proliferation and promotion of its apoptosis.

Pregnancy；PM2.5；newborn mouse；liver；PCNA；caspase-3

R317

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.005

2016-07-15

2016-10-10

山东省自然科学基金项目（ZR2014JL016）

巩艳，女（1988年），汉族，研究生在读

（To whom correspondence should be addressed）：yulidoctor＠wfmc.edu.cn，jianghongwf＠126.com