地被银桦试管苗增殖培养研究

李湘阳　曾炳山　裘珍飞

摘 要 地被银桦是杂交品种，无性繁殖对保持地被银桦的品种特性至关重要。本研究以组织培养为繁殖方法，从激素的浓度、种类、大量元素及糖等方面对地被银桦的增殖培养进行了系统的研究。结果表明，6-BA的浓度对增殖苗的高度有显著影响，6-BA和IBA对试管苗的玻璃化比例均有显著影响，NH4NO3和KH2PO4的浓度也显著影响增殖苗的高度。最适增殖培养基配方为：改良MS培养基（NH4NO3 412.5 mg/L ，KH2PO4 85 mg/L）+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L+糖35 g/L。

关键词 地被银桦 ；组织培养 ；增殖

中图分类号 Q813.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.10.007

Abstract Grevillea Billy Bonkers is a hybrid Grevillea. Vegetative propagation plays an important role in keeping varietal characteristics of Billy Bonkers. Billy Bonkers was mass proliferated via tissue culture， and the hormones and their concentrations， macro-elements and sugar were modified to develop an optimal MS medium for tissue culture of Billy Bonkers. The results indicated that the concentrations of 6BA， NH4NO3 and KH2PO4 had significant effect on plantlet height growth of Billy Bonkers. The 6BA and IBA had significant effect on plantlet vitrification ratio. The optimal medium for tissue culture is （NH4NO3 412.5 mg/L， KH2PO4 85 mg/L） + 6BA 0.3 mg/L + IBA 0.1 mg/L + sugar 35 g/L.

Keywords Grevillea Billy Bonkers ； tissue culture ； proliferation

银桦属植物（Grevillea）是山龙眼科（Proteaceae）能绽放大型花序的植物，原产于澳大利亚、新几内亚、新喀里多尼亚岛和印度尼西亚中部的苏拉威西岛。地被银桦不仅花型好看、颜色艳丽、花期长、具有很高的观赏价值，而且耐旱能力强，应用于庭院绿化和景观工程的管护成本低，具有较好的市场前景。然而地被银桦是一个杂交种，难以获得正常种子，而且种子繁殖也难以保持杂交品种的优良特性，只有通过无性繁殖方式（如组织培养、扦插繁殖）获得的种苗才能保证母本植物的优良特性。目前已有部分银桦属观赏植物的组织培养取得成功，如白翅银桦（G. leucopteris）[1]、绵毛银桦（G. lanigera）[2]、莫丽银桦（G. molly）[3]、月光银桦（G. moonlight）[4]等，但地被银桦的组织培养研究尚未见报道。本课题组开展了地被银桦的组织培养研究，建立了一套成熟的试管苗繁殖体系，为地被银桦的推广应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

材料来源于中国林业科学研究院热带林业研究所苗圃。

1.2 方法

1.2.1 采集外植体

选降雨量较少的6～9月取材，在天气持续晴朗5天后，于上午9点～10点，采集新萌条的顶梢25～30 cm，剪去叶片后将其放入干净保鲜袋中，并及时带回实验室进行消毒处理。

1.2.2 外植体消毒

用洗衣粉溶液浸泡枝条30 min，然后在自来水下冲洗干净；将枝条切成3～4 cm长、带1～2个叶腋的茎段，在超净工作台上用0.1%的HgCl2浸泡消毒3～7 min，期间不断摇动确保消毒液与枝条充分接触；然后用无菌水清洗4次，每次5 min。

1.2.3 丛芽诱导与继代增殖培养

将茎段两端各切去0.5 cm，留下中间含叶腋的茎段作为无菌外植体，将其接种到丛芽诱导培养基上；诱导3～5个月，形成丛芽后，将其转接到继代增殖培养基上进行增殖和扩繁。

1.2.4 激素对增殖苗的影响

将地被银桦试管苗分别接种于8种含不同浓度6-BA和IBA的培养基中（1）：6-BA 0.2 mg/L；（2）：6-BA 0.3 mg/L；（3）：6-BA 0.4 mg/L；（4）：6-BA 0.5 mg/L；（5）6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L；（6）6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L；（7）6-BA 0.4 mg/L+IBA 0.1 mg/L；（8）6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L。每种培养基中NH4NO3的浓度均为1/4 MS，KH2PO4的浓度均为1/2 MS，每个处理重复10瓶，每瓶接4株试管苗。

1.2.5 NH4NO3对增殖苗的影响

将地被银桦试管苗分别接种于含不同浓度NH4NO3（0 MS、1/4 MS、1/2 MS、1 MS）的增殖培养基中，每个处理重复6瓶，每瓶接4株试管苗。

1.2.6 KH2PO4对增殖苗的影响

将地被银桦试管苗分别接种于含不同浓度KH2PO4（1/4 MS、1/2 MS、3/4 MS、1 MS）的增殖培养基中，每个处理重复6瓶，每瓶接4株试管苗。

1.2.7 蔗糖对增殖苗的影响

将地被银桦试管苗分别接种于含不同浓度糖（30、35、40、45 g/L）的增殖培养基中，每个处理重复6瓶，每瓶接4株试管苗。

以上各组实验所用培养基中均添加琼脂粉6 g/L，培养基pH值为5.8，培养温度为（25±2）℃，光照时间12 h/d，光照强度2 000 lx。所有处理均培养4周，之后统计试管苗的高度、增殖率及玻璃化苗比例。受污染影响，试验结束时可测定的重复数不等。

1.2.8 数据处理

所得数据用SAS软件进行不等重复试验方差分析，显著水平为0.05，极显著水平为0.01。

2 结果与分析

2.1 激素对增殖苗的影响

试验结果表明，培养基中的6-BA浓度影响地被银桦试管苗的增殖倍数。随着6-BA浓度的升高，增殖倍数逐步上升（图1），但同时试管苗的高度在迅速下降（图2），玻璃化苗比例上升（图3）。方差分析显示，6-BA浓度的变化对地被银桦增殖倍数的影响在不同处理间差异不显著（表1），但试管苗的高度在不同处理间表现出极显著差异（表2），玻璃化苗比例也表现出显著差异（表3）。

IBA对增殖苗的影响是双向的。一方面培养基中加入IBA后增殖倍数普遍表现为上升的趋势（图1），但差异不显著（表1）；另一方面IBA的加入也导致试管苗玻璃化的比例显著上升（图3），且不同处理间表现出显著差异（表3）。IBA对试管苗的高度有一定影响，即在加入IBA后，尽管试管苗的高度也会随着6-BA浓度的升高而下降，但下降的幅度会减少（图2），且不同处理间的差异不显著（表2）。

虽然方差分析表明6-BA与IBA的联合作用对地被银桦试管苗的增殖倍数、高度及玻璃化比例的影响在不同处理间差异不显著（表1～3），但实际的数据显示，当培养基中加入少量IBA后，在培养基中6-BA浓度相同的情况下，增殖倍数都略有升高（图1），IBA会减缓因6-BA浓度的升高而导致的试管苗高度下降（图2），同时IBA有加剧试管苗玻璃化的倾向（图3）。综合考虑增殖倍数、试管苗高度及玻璃化的状况， 认为6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L的培养基配方比较适合地被银桦试管苗的增殖培养。

2.2 NH4NO3浓度对增殖苗的影响

培养基中的NH4NO3浓度的变化导致试管苗高生长量发生巨大变化（图4）。方差分析表明，NH4NO3对地被银桦试管苗高生长有极显著影响（表4）。当培养基中NH4NO3的浓度为0时，试管苗的平均苗高生长为1.64 cm；但当NH4NO3的浓度增至825 mg/L（1/2 MS）时，试管苗高生长量却降至0.94 cm，不过加入少量的NH4NO3（412.5 mg/L）（1/4 MS）对地被银桦试管苗高生长还是有促进作用的。

2.3 KH2PO4浓度对增殖苗的影响

培养基中KH2PO4的浓度对地被银桦试管苗高生长有重要影响（图5）。当KH2PO4浓度太低时（42.5 mg/L，即1/4 MS），试管苗普遍矮小，平均苗高生长量只有0.38 cm；当KH2PO4浓度上升至85 mg/L（1/2 MS）时，试管苗平均苗高生长量随即升高至1.96 cm，但当继续提高KH2PO4浓度至127.5 mg/L（3/4 MS）时，试管苗高度又开始下降，可见地被银桦试管苗对P也是比较敏感的，适合用偏低浓度的P进行组织培养。方差分析显示，KH2PO4对地被银桦试管苗的苗高生长量有极显著影响（表5）。

2.4 蔗糖对地被银桦试管苗的影响

适当增加培养基中蔗糖的浓度，能提高地被银桦试管苗的高度，但如果蔗糖浓度过高，试管苗的高度又会下降（图6）。这说明蔗糖作为地被银桦试管苗组织培养中的碳源对试管苗的生长起着比较重要的作用，合适的浓度能促进试管苗的生长，但浓度过高可能改变了培养基的渗透环境，影响了试管苗对其它物质的吸收，从而导致试管苗高生长量下降。方差分析表明，蔗糖对试管苗高生长量的影响差异不显著（表6）。

3 讨论与结论

3.1 讨论

一般认为，6-BA在培养基中的作用是诱导芽的分化及促进侧芽萌发生长[5]。在一定范围内，随着6-BA浓度的增加，试管苗的增殖倍数会升高[6-9]。地被银桦主要是以侧芽萌发的方式进行繁殖，提高6-BA的浓度能促进试管苗的增殖，但却导致试管苗的高度下降，在高粱泡组培研究中也发现类似的情况[6]。IBA是生长素类激素，通常认为其在组织培养中能促进细胞分裂和细胞伸长生长[5]，往培养基中加入IBA后，在6-BA浓度相同的情况下，地被银桦试管苗的高度有所增加。在对山新杨[7]、变叶金银木[10]进行组织培养研究时也发现，适当浓度的生长素类激素能提高芽苗的高度。

Mujib等[11]认为，BA是组培试管苗玻璃化的根源。徐涌等[12]在研究吴茱萸组织培养时证明，适当质量浓度的6-BA能提高增殖率，但质量浓度过高则容易导致玻璃化。本研究结果也表明，6-BA是影响试管苗玻璃化率的重要因子，同时IBA也对地被银桦试管苗的玻璃化有显著影响，这说明无论是细胞分裂素还是生长素类激素都对试管苗的玻璃化有显著影响。莫丽银桦[3]、月光银桦[4]的组织培养研究结果也证明，6-BA、NAA、IBA浓度的上升容易导致组培苗出现玻璃化现象。在其它植物如铁线莲[13]、洋桔梗[14]的组培研究中也表明，当6-BA相同浓度时，提高生长素类激素浓度会增加试管苗玻璃化比例。

MS培养基是目前应用最广泛的培养基，大多数植物都能在MS培养基上较好地生长，但是铵对不少培养物有抑制生长的作用[15]。刘正娥等[16]在研究孝顺竹的组培快繁时发现，当NH4NO3在0～2 475 mg/L时，苗高随着浓度的升高有所下降；当KH2PO4在85～255 mg/L时，苗高随浓度的升高而增加，其中浓度为255 mg/L时苗高最高，之后随其浓度的升高而下降。MS培养基中蔗糖的标准浓度是3%[15]，然而不同的植物对碳源的需求并不一样。李林等[17]研究了蔗糖浓度为10～50 g/L时对美国黄松不定芽增殖和生长的影响，证明不定芽的增殖率在蔗糖浓度为20 g/L时最大，之后随着蔗糖浓度的增加而下降。周逊等[18]在研究遵义大白姜的组织培养时发现，当蔗糖浓度为0～100 g/L时，随着蔗糖浓度的升高，大白姜的生长量直线上升，但继续升高蔗糖浓度后，试管苗的生长开始受到抑制。因此，采用MS培养基进行组织培养时有必要根据试管苗的状况进行适当的调整。本研究结果表明，MS培养基中不同浓度的NH4NO3和KH2PO4对地被银桦试管苗生长的影响均达到极显著差异水平，较高浓度的NH4NO3和KH2PO4均会抑制地被银桦试管苗高生长，而将培养基中糖的浓度提高到3.5%时，试管苗的生长量会上升。所以，在对地被银桦进行组织培养时，应采用较低浓度的NH4NO3和KH2PO4，并适当提高糖的浓度。

3.2 结论

地被银桦在进行组织培养时容易出现试管苗玻璃化现象，而激素浓度对试管苗的玻璃化有显著影响，因此只能采用较低浓度的激素组合。另外，地被银桦试管苗的生长量受到激素浓度、NH4NO3和 KH2PO4含量以及蔗糖浓度的影响，必须对常规MS培养基进行改良才能保证试管苗的正常生长。最适增殖培养基为：改良MS培养基（NH4NO3 412.5 mg/L，KH2PO4 85 mg/L）+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L+糖35 g/L。

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