虎耳草精油化学成分及其抑菌活性

张知侠

(咸阳师范学院 化学与化工学院，陕西咸阳 712000)



虎耳草精油化学成分及其抑菌活性

张知侠

(咸阳师范学院 化学与化工学院，陕西咸阳 712000)

采用水蒸气蒸馏法提取虎耳草精油，通过气相色谱-质谱联用法(GC-MS)对精油进行成分分析。鉴定出35种化学成分，占总馏出峰面积的 78.22%，主要成分为十五烷酸27.93%， (2E,5E)-3,4,5,6-四甲基-2-5-辛二烯6.28%、邻苯二甲酸丁酯辛酯5.54%、9-十六碳烯酸5.01%。生长速率法测定表明，虎耳草精油对小麦全蚀病菌和番茄早疫病菌的抑制活性较高，在500 mg/L剂量下抑制率均在90%以上；对玉米大斑病菌和油菜菌核病菌在750 mg/L剂量下的抑制率在80% 以上，而对其他几种病菌的抑制率相对较低。

虎耳草；精油；化学成分；抑菌活性

虎耳草[Saxifragastolonifera(L.)Meerb.]为虎耳草科虎耳草属的多年生草本植物，产于河北、陕西、甘肃的东南部、江苏、浙江、安徽、湖北北部等地。其主要成分有岩白菜素、槲皮素、原儿茶酸、虎耳草素、黄酮、山奈酚、芦丁、槲皮素-3 -鼠李糖苷、没食子酸、琥珀酸、反甲基丁烯二酸、正十六烷酸、8,10 二甲氧基-十八烷酸、辛酯二烯等[1-5]。虎耳草全草可入药，其性状略带微辣、味微苦，有消肿祛湿和清热解毒的作用。在中国民间很早就用来治疗急性中耳炎、烫伤，效果明显，虎耳草还具有消炎、镇痛、止血、止咳的作用。近年来，对虎耳草的药理研究取得了新的进展，研究发现虎耳草乙酸乙酯、乙醇提取物可抑制前列腺癌细胞的增殖，对治疗前列腺癌细胞有诱导凋亡作用[6]，乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌有抑制作用[7]，其中岩白菜素没食子酸酯类对丙型肝炎丝氨酸蛋白酶具有一定抑制活性[8]，活性成分槲皮素对人的胃腺癌细胞增殖具有抑制作用[9]，虎耳草总黄酮可提高抗氧化酶活力，具有抗衰老作用[10], 虎耳草还可用来治疗乳腺小叶增生症[11]。可见，虎耳草在药用方面有很高的研究价值。本试验对虎耳草精油的化学成分及其抑菌活性进行研究，旨在充分挖掘虎耳草精油作为农药的有效成分，为开发天然产物农药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

虎耳草全草购置于成都中药材市场，产地四川。粉碎过30 目筛后于-20 ℃冰箱中保存备用。

供试病原菌：玉米大斑病菌 [Exserohilumturcicum(Pass.)Leonard & Suggs];番茄早疫病菌 [Alternariasolani(Ell,et Mart) Johnes et Grout]、辣椒疫霉病菌 (PhytophthoracapsiciLeonian)、番茄灰霉病菌 (BotrytiscinereaPers. ex Frs.)、番茄枯萎病菌 (Fusariumoxysporumf.sp. Lycopersici Snyder et Hansen)、苹果腐烂病菌 (ValsamaliMiyabe et Yamada)、黄瓜黄萎病菌 (VerticilliumdahliaeKleb)、小麦全蚀病菌 [Gaeumannomycesgraminis(Sacc.) Arx.et Olivier]、油菜菌核病菌 [Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary]、小麦赤霉病菌 [Fusariumgiaminearum(Schw.) Petch]，均由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。试验中辣椒疫霉病菌用V8 培养基培养, 其余病菌用 PDA 培养基培养。

1.2 仪 器

全自动蒸汽灭菌锅(D-1型)，旋转蒸发仪(R213型)，智能型生化培养箱(SPX-150B型 )，日本岛津(SHIMADZU)GC-MS/QP2010 型气相色谱-质谱联用仪。

1.3 试验方法

1.3.1 虎耳草精油提取 称取虎耳草试验样品60 g于1 000 mL蒸馏烧瓶中，加350 mL蒸馏水浸泡2 h后，采用水蒸气蒸馏法[12]连续蒸馏8 h，共收集馏出液2 000 mL，将此馏出液经氯化钠饱和后用石油醚萃取3次，合并石油醚萃取液加无水硫酸钠干燥, 将干燥后的萃取液利用旋转蒸发仪浓缩回收石油醚, 即得虎耳草精油。

1.3.2 GC-MS分析 气相色谱条件: 岛津CBP5-M25-025弹性石英毛细管色谱柱(25 m×0.25 mm×0.25 μm) ; 载气为纯度99.995%的氦气; 柱初温 60 ℃, 保温 2 min, 以 10 ℃/min升温速率升至 240 ℃, 保温 2 min; 进样口温度 260 ℃；柱前压 63.4 kPa, 分流比 1∶100; 进样量 1 μL。

质谱条件: EI 离子源, 电子能量 70 eV,电子倍增器电压0.97 V，质量扫描范围 29m/z～350m/z, 离子源温度 200 ℃, 接口温度230 ℃，溶剂峰切除时间 2.0 min, 质谱检测起测时间 2.5 min。质谱图计算机检索数据库NIST 147 。

1.3.3 抑菌活性测定 采用生长速率法[13]测试虎耳草精油的抑菌活性，选用玉米大斑病菌、番茄早疫病菌等10种病原菌。配制虎耳草精油的丙酮溶液: 采用虎耳草精油配制成质量浓度为 1 500 mg/L 的母液, 然后将其进行稀释成质量浓度分别为1 500、1 200、1 000、750、500 mg/L的系列溶液, 在无菌条件下将配制的不同质量浓度的虎耳草精油溶液分别加入到冷却至50 ℃的PDA 培养基(辣椒疫霉病菌用 V8培养基)中。每次取1 mL虎耳草精油溶液加入到9 mL的培养基中，混合均匀倒入直径为90 mm的培养皿，制成带毒的平板培养基, 然后在平面上接种供试的病原菌, 每浓度处理重复3次。 在 26 ℃下置于生化培养箱进行培养, 72 h后通过卡尺用十字交叉法测量供试真菌菌落生长直径,取其平均值。根据公式(1)和(2)计算菌丝生长抑制率。

菌落生长直径= 2次直径平均值-4.0(菌饼直径)

(1)

菌丝生长抑制率=(对照菌生长直径-处理菌落直径)/对照菌落生长直径×100%

(2)

2 结果与分析

2.1 虎耳草精油收率

采用水蒸气蒸馏法得到的虎耳草精油为黄色具有特殊气味的油状液体。称量后计算虎耳草精油收率为0.712%。

2.2 虎耳草精油化学成分的GC-MS分析

按“1.3.2”的试验方法和条件，对精油的化学成分进行GC-MS 分析, 得虎耳草精油的总离子流图1。应用 SHIMADZUGCMSsolution Release 2.10 专业分析软件对总离子流图进行分析，得到 35 个色谱峰, 按色谱峰面积归一法确定各组成化合物的相对百分含量。成分鉴定根据 GC-MS 联用测定所得到的质谱信息, 应用 NIST147 数据库进行检索, 通过与标准谱图对照、分析，确定虎耳草精油的成分有35种,占总馏出峰面积的 78.22%。其成分含量最高的为十五烷酸(27.93% )， 其次是 (2E,5E)-3,4,5,6-四甲基-2-5-辛二烯(6.28%)、邻苯二甲酸丁酯辛酯(5.54%)、9-十六碳烯酸(5.01%)。还含有少量其他的烃类、醇类、酸类和烯类等(表1)。

图1 虎耳草精油总离子流图

2.3 虎耳草精油抑菌活性测试

用生长速率法测试表明，虎耳草精油对供试的10种病原菌表现出不同程度的抑菌活性。其对小麦全蚀病菌和番茄早疫病菌的抑制活性最强，在500 mg/L剂量下抑制率均在90%以上；对玉米大斑病菌和油菜菌核病菌的抑制活性次之，在750 mg/L剂量下抑制率均在80%以上，而对其他几种供试病菌的抑制活性相对较低(表2)。

表1 虎耳草精油化学成分与相对含量

表2 虎耳草精油对10种病原菌的抑制效果

3 结 论

利用水蒸气蒸馏法获得虎耳草精油。通过 GC-MS方法对其精油进行成分分析，鉴定出35 个成分，占总馏出峰面积的 78.22%。检测得到虎耳草精油化学成分含量最高的是十五烷酸(27.93%)， 其次是 (2E,5E)-3,4,5,6-四甲基-2-5-辛二烯(6.28%)、邻苯二甲酸丁酯辛酯(5.54%)、9-十六碳烯酸(5.01%)。这与先春等[14]、左国营等[2]对虎耳草成分研究结果差异很大，原因除研究方法不同，与产地气候土壤等因素也有一定关系。

通过对供试病原菌的抑菌试验测定发现，虎耳草精油对小麦全蚀病菌和番茄早疫病菌的抑制活性最强，试验质量浓度下抑制率均在90%以上，对玉米大斑病菌和油菜菌核病菌的抑制率在75%以上，对其他几种病菌也有不同程度的抑制率。该结果与钮绪燕等[15]用石油醚和二氯甲烷对虎耳草提取物所做的抑菌效果是一致的。由此可见，虎耳草精油含有重要的抑菌活性成分，目前的效果只是精油综合作用的结果，具体的单体活性成分有待进一步分离鉴定，并通过进一步的抑菌试验，有可能发现具有新型杀菌活性的先导化合物, 为新型抑菌剂的创制奠定基础。

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Received 2016-01-21 Returned 2016-04-01

Foundation item Scientific Researching Funding Projects form Xianyang Normal University (No.13XSYK026).

About author ZHANG Zhixia, female, senior engineer. Research area: natural products analysis and application.E-mail:zhazhixia@126.com

(责任编辑：史亚歌 Responsible editor:SHI Yage)

Chemical Constituents and Antibacterial Activity of Essential Oil fromSaxifragastolonifera

ZHANG Zhixia

(Department of Chemistry, Xianyang Normal University, Xianyang Shaanxi 71200,China )

The essential oil ofSaxifragastoloniferawas extracted by steam distillation. Components of the essential oil were analyzed by GC-MS and 35 components were identified, accounting for 78.22% of total compositions. The essential oils mainly consisted of pentadecanoic acid(27.93%), (2E,5E)-3,4,5,6-tetramethy -2,5-octadiene(6.28%), phthalic acid,butyl octyl ester(5.54%) and 9-hexadecenoic acid (5.01%). The test of inhibition rate against mycelial growth showed that essential oil fromSaxifragastoloniferahad good antifungal effects, and the inhibition rates surpassed 90% at the concentrations of 500 mg/L against gaeumannomyces graminis andAlternariasolani, at 500 mg/L dose，and above 80% ofExserohilumturcicumand sclerotinia scleroticorum，at 750 mg/L dose，and the rest of the fungus had weaker inhibition.

Saxifragastolonifera; Essential oils ; Extract; Antifugal activity

2016-01-21

2016-04-01

咸阳师范学院科研基金(13XSYK026)。

张知侠,女,高级工程师, 研究方向为天然产物分析及其应用。E-mail:zhazhixia@126.com

日期：2016-10-20

O629.9

A

1004-1389(2016)10-1536-05

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1655.034.html