海洋真菌Schizochytrium sp.DP-16发酵产DHA油脂过程的优化

徐 涛， 董 天 飞， 陈 明， 范 胜 男， 史 超

( 1.大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034；2.赤峰工业职业技术学院， 内蒙古 赤峰 024005 )



海洋真菌Schizochytriumsp.DP-16发酵产DHA油脂过程的优化

徐 涛1， 董 天 飞2， 陈 明1， 范 胜 男1， 史 超1

( 1.大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034；2.赤峰工业职业技术学院， 内蒙古 赤峰 024005 )

利用一株海洋真菌Schizochytriumsp. DP-16发酵产DHA，对其发酵过程进行了优化，并利用气质联用(GC-MS)对其脂肪酸组成进行了分析。通过单因素试验确定了发酵培养基配方和培养条件，在优化条件下培养120 h，细胞生物量达65.0 g/L，油脂产量达30.7 g/L，DHA达8.9 g/L。GC-MS分析表明Schizochytriumsp. DP-16细胞中共检出8种脂肪酸，主要含有C14：0 和C16：0两种饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸主要包括DPA和DHA，其中DHA质量分数达28.784%。

海洋真菌；裂殖壶菌；DHA；发酵优化；气质联用

0 引 言

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)是一种重要的ω-3多不饱和脂肪酸，具有降血脂、增强视力、促进脑细胞发育等生理功效[1]，广泛用于食品医药行业，被誉为新一代功能因子，人体自身难以合成，必须从外界摄取。传统的DHA主要来源于深海鱼油，但品质与产量难以满足商业化发展需求，而微生物来源DHA具有含量高、质量好、过程可控、产量稳定等优点，成为目前的研究热点[2]。

裂殖壶菌(Schizochytrium)是一种富含DHA的海洋真菌，具有生长快、易培养、细胞内油脂和DHA含量高等优点，是商业化生产DHA的理想生产菌之一[3]。近年来国内外围绕裂殖壶菌产DHA的菌种选育、DHA合成途径、油脂积累机制、油脂提取等方面进行研究，取得了一些研究成果，而如何提高DHA产量一直是裂殖壶菌发酵产DHA的重点内容[4-6]。本实验利用一株裂殖壶菌Schizochytriumsp. DP-16发酵产DHA，对其发酵过程进行了优化，并利用气质联用(GC-MS)对其油脂的脂肪酸组成进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

Schizochytriumsp. DP-16，本实验室保藏。

1.1.2 培养基

种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母浸粉10，蛋白胨2，海水晶15，pH 6.0。

基础发酵培养基(g/L)：葡萄糖70，酵母浸粉10，蛋白胨10，海水晶15，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·H2O 4，pH 6.0。

1.1.3 试剂与仪器

BF3-甲醇溶液、DHA甲酯，上海安谱科学仪器有限公司，甲醇、氯仿、正己烷等均为分析纯。

7890型气相色谱-5975型质谱联用仪，Agilent Technologies。

1.2 方 法

1.2.1 种子液的制备

将菌种转接于斜面，25 ℃培养3 d后，挑取2～3环接入装有40 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，25 ℃、200 r/min振荡培养2 d。

1.2.2 摇瓶发酵

按10%接种量将种子液接入装有40 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，25 ℃、200 r/min振荡培养4 d，测定菌体生物量及油脂产量。

1.2.3 发酵条件优化

利用单因素试验，依次对碳源种类和浓度、氮源种类和浓度、无机盐浓度、接种量、摇瓶装液量、发酵时间进行优化。

1.2.4 生物量测定

取2 mL发酵液，10 000 r/min离心15 min，弃上清，菌体沉淀置于80 ℃干燥至恒重，称量。

1.2.5 葡萄糖含量测定

采用DNS法测定葡萄糖含量[7]。

1.2.6 油脂含量测定

取发酵液5 mL，离心后弃上清，加入5 mL 4 mol/L HCl，置于沸水浴中10 min，加入10 mL体积比2∶1氯仿-甲醇混匀，离心后取氯仿层，加等体积的0.1% NaCl溶液，振荡混匀，取氯仿层至干燥的试管中，70 ℃干燥至恒重，称量。

1.2.7 油脂脂肪酸组成的GC-MS分析

脂肪酸的甲酯化按文献[8]进行。取2 mL发酵液，加3 mL水，4 000 r/min离心5 min，弃上清。将沉淀用7 mL 1 mol/L NaOH-甲醇溶液分两次转入100 mL磨口瓶中，加塞，置70 ℃ 水浴下皂化30 min，加入7 mL 14% BF3-甲醇溶液，70 ℃水浴下甲酯化反应30 min。冷却，加入10 mL饱和NaCl溶液及3 mL正己烷，振荡混匀，静置，取上层有机相于4 000 r/min离心5 min，吸取上层有机相用于GC-MS分析。

气相色谱条件：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度为260 ℃；载气为高纯度氦气，体积流量为1 mL/min，进样量1 μL，分流比1∶10；柱温采取程序升温：初始温度140 ℃，维持5 min，以4 ℃/min升温至240 ℃，240 ℃维持15 min。质谱条件：离子源温度230 ℃；接口温度280 ℃；质量扫描范围35～450 u，scan全扫描方式。

2 结果与讨论

2.1 培养基的优化

2.1.1 碳源种类的影响

分别选用果糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖和菊糖为发酵培养基碳源，质量浓度均为70 g/L，菌体利用不同碳源产DHA的结果如图1所示。结果表明，7种碳源均可被菌体利用，其中以葡萄糖为碳源时菌体生物量和油脂产量最高，果糖和半乳糖次之，木糖、乳糖、麦芽糖和菊糖较差，因此选择葡萄糖为碳源。

2.1.2 碳源质量浓度的影响

改变发酵培养基中初始葡萄糖浓度，考察葡萄糖浓度对DHA油脂发酵的影响。如图2所示，在葡萄糖质量浓度70～100 g/L，生物量和油脂产量随葡萄糖质量浓度的增大而略有增加。当葡萄糖质量浓度为110 g/L时，生物量和油脂产量达到最大，分别为16.8和4.2 g/L，进一步增加葡萄糖质量浓度，生物量和油脂产量均降低，可能是由于葡萄糖质量浓度过高对菌体生长产生了一定程度的抑制。因此选择初始葡萄糖质量浓度为110 g/L。

图1 碳源种类对菌体生物量和油脂产量的影响

图2 初始葡萄糖质量浓度对菌体生物量和油脂产量的影响

Fig.2 Effects of initial glucose concentrations on the biomass and lipid yields of the strain

2.1.3 氮源种类的影响

氮源包括有机氮源和无机氮源，有机氮源有利于产油脂微生物细胞生长，尤以酵母浸粉能较好地促进DHA油脂积累[9-10]。以酵母浸粉为基础氮源，考察添加其他氮源(10g/L)对DHA油脂发酵的影响，结果见图3。结果表明，添加谷氨酸钠能够有效促进菌体生长和油脂积累，因此，选择酵母浸粉和谷氨酸钠组成的复合氮源。

图3 氮源种类对菌体生物量和油脂产量的影响

2.1.4 氮源添加量的影响

改变发酵培养基中谷氨酸钠添加量，考察谷氨酸钠浓度对菌体发酵产DHA油脂的影响，结果见图4。在谷氨酸钠添加量为5～50g/L，谷氨酸钠添加量对生物量和油脂产量的影响不大，当谷氨酸钠添加量为10g/L时，生物量和油脂产量达到最大值，所以选择谷氨酸钠质量浓度为10g/L。

图4 谷氨酸钠添加量对菌体生物量和油脂产量的影响

Fig.4 Effects of monosodium glutamate amounts on biomass and lipid yields of the strain

2.1.5 无机盐质量浓度的影响

无机盐对微生物的生长和代谢具有重要作用，如磷酸盐是微生物生长所必需的，K+与细胞渗透压和透性有关，Mg2+是多种酶的激活剂，能够促进糖代谢[11]。

在优化培养基中添加MgSO4·7H2O质量浓度分别为2、5、8g/L，KH2PO4·H2O质量浓度分别为1、4、7g/L，采用不同组合方式考察无机盐质量浓度对Schizochytriumsp.DP-16发酵产DHA油脂影响，结果如表1所示。结果表明，当MgSO4·7H2O为5g/L、KH2PO4·H2O为7g/L时，细胞生物量和油脂产量达到最大。

2.2培养条件的优化

2.2.1 接种量的影响

研究了不同接种量对Schizochytriumsp.DP-16生长和油脂积累的影响，如图5所示。结果表明，在接种量为2%～10%，生物量及油脂积累与接种量的大小表现出正向相关性；进一步扩大接种量至13%，菌体生物量和油脂产量均降低，这可能是由于接种量过大，菌体生长过快，从而使发酵液黏度增加，导致溶氧不足所致。因此选择适宜的接种量为10%。

表1 无机盐质量浓度对菌体生物量和油脂产量的影响

Tab.1 Effects of inorganic salt concentrations on biomass and lipid yields of the strain

实验号ρ(MgSO4·7H2O)∶ρ(KH2PO4·H2O)ρ/(g·L-1)生物量油脂产量18∶134．57．228∶437．57．338∶734．06．845∶138．57．755∶433．06．665∶739．59．572∶134．57．582∶437．57．992∶732．56．5

图5 接种量对菌体生物量和油脂产量的影响

2.2.2 装液量的影响

研究了不同装液量对Schizochytriumsp. DP-16生长和油脂积累的影响，结果如图6所示。结果表明，摇瓶装液量DHA影响较大，250 mL三角瓶中随着发酵培养基装液量的增加，生物量和油脂产量先上升后急剧下降，这可能是因为该发酵过程需要适宜的溶氧量。当装液量为30 mL时，生物量达57.5 g/L，油脂产量为14.9 g/L。

图6 装液量对菌体生物量和油脂产量的影响

2.2.3 培养时间的影响

利用优化后的培养基配方，在摇瓶装液量30 mL、接种量为10%条件下，研究了Schizochytriumsp. DP-16发酵产DHA油脂的时间进程，其中生物量和葡萄糖质量浓度每隔12 h测定，油脂和DHA产量每隔24 h测定，结果如图7所示。结果表明，随着发酵的进行，葡萄糖被Schizochytriumsp. DP-16细胞利用，其质量浓度逐渐降低，同时细胞生物量、油脂产量和DHA质量浓度随发酵时间延长而不断提高，在120 h时达到最高值，分别为65.0、30.7和8.9 g/L。因此，确定适宜的发酵时间为120 h。

a) 葡萄糖和生物量

b) 脂肪酸和DHA

图7Schizochytriumsp. DP-16发酵产DHA油脂的时间进程

Fig.7 Time course of fermentation by Schizochytrium sp. DP-16 for DHA lipid production

2.3 油脂的脂肪酸组成分析

对Schizochytriumsp.DP-16油脂的脂肪酸组成进行GC-MS分析，图8为总离子色谱图。对总离子色谱图的各色谱峰选择美国国家标准研究所(NIST)标准质谱库数据系统进行检索分析，结果表明，脂肪酸甲酯对应的色谱峰保留时间为13～31min，共检出8种脂肪酸，分析结果如表2所示。结果表明，Schizochytriumsp.DP-16油脂中主要含有C14：0和C16：0两种饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸主要包括DPA和DHA，其中DHA质量分数达28.784%。

图8 Schizochytriumsp.DP-16油脂GC-MS分析的总离子色谱图

Fig.8 Total ions chromatograph profile of Schizochytrium sp. DP-16 fatty acids analyzed by GC-MS

表2 Schizochytrium sp. DP-16的脂肪酸组成

3 结 论

对Schizochytriumsp. DP-16发酵产DHA的过程进行了优化，确定了其发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖110，酵母浸粉10，谷氨酸钠10，海水晶15，MgSO4·7H2O 5 ，KH2PO4·H2O 7；培养条件为种龄48 h，接种量10%，装液量250 mL 摇瓶装液30 mL，初始pH 6.0，25 ℃下培养120 h，其生物量达65.0 g/L，油脂30.7 g/L，DHA 8.9 g/L。GC-MS分析结果表明，Schizochytriumsp. DP-16油脂中主要含有C14：0和C16：0两种饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸主要包括DPA和DHA，其中DHA质量分数达28.784%。

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Optimization of fermentation process by a marine fungus strainSchizochytriumsp. DP-16 for DHA lipid production

XU Tao1, DONG Tianfei2, CHEN Ming1, FAN Shengnan1, SHI Chao1

( 1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China； 2.Chifeng Industry Vocational Technology College, Chifeng 024005, China )

The fermentation process of Schizochytrium sp. DP-16 for DHA lipid production was optimized by single factor test, and the composition of cell fatty acids was analyzed as fatty acid methyl esters derivatives (FAMEs) by GC-MS. The results showed that the biomass, lipid production and DHA concentration could reach to 65.0, 30.7 and 8.9 g/L respectively at 120 h under optimized conditions. Eight fatty acids were detected in Schizochytrium sp. DP-16 cells by GC-MS, in which the main saturated fatty acids were C14:0 and C16:0 acid, and the main polyunsaturated fatty acids were DPA and DHA. The content of DHA in Schizochytrium sp. DP-16 cells accounted for 28.784% of the total fatty acids.

marine fungus;Schizochytriumsp.; DHA; fermentation optimization; GC-MS

2015-05-16.

辽宁省自然科学基金资助项目(2014026011).

徐 涛(1990-)，男，硕士研究生；通信作者：陈 明(1979-)，男，副教授.

TS225.6；Q815

A

1674-1404(2016)06-0411-05

XU Tao, DONG Tianfei, CHEN Ming, FAN Shengnan, SHI Chao. Optimization of fermentation process by a marine fungus strainSchizochytriumsp. DP-16 for DHA lipid production[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(6): 411-415.