笃斯越橘果实花青素提取及稳定性研究

李阳阳，彭瞰看，杨九双，巨安基，徐永清

（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030）

笃斯越橘果实花青素提取及稳定性研究

李阳阳，彭瞰看，杨九双，巨安基，徐永清*

（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030）

以笃斯越橘果实为材料，利用超声波辅助乙醇提取，并采用正交试验设计，对笃斯越橘果实花青素进行提取，确定其花青素最佳提取条件为：提取温度40℃，最佳料液比3∶30（g/mL），最佳超声波功率200W，最佳提取液浓度65%的酸化乙醇。对笃斯越橘果实花青素的稳定性研究结果表明：笃斯越橘果实花青素对pH值敏感；笃斯越橘果实花青素对氧化剂稳定性较差；笃斯越橘果实花青素对还原剂稳定性较强；在pH值为3.0时笃斯越橘果实花青素对Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Al3+较稳定；笃斯越橘果实花青素弱光稳定性较好，强光稳定性较差。

笃斯越橘；花青素；提取；稳定性

笃斯越橘（Vaccinium uliginosum L.）又称笃斯、蓝莓、黑豆树，甸果、地果等，杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium L.）落叶灌木，是我国重要的野生资源之一，主要分布在内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁等地区[1-2]。笃斯越橘是一种小浆果，果肉细腻，种子极小，它是我国重要的野生浆果资源，具有许多特殊的优良性状，如抗寒能力极强、花青素含量高等有着很高的营养和保健价值[3-6]。蓝莓果实不仅营养丰富，而且含有有机酸、氨基酸、花色苷等独特的功能性成分[7-10]，具有防治心血管疾病、抗癌、抗衰老等多种功效[11-14]。笃斯越橘和越橘是我国面积最大、贮量最多的野生浆果资源[15-16]，多生长在人烟稀少，远离农区的深山中，无化肥和农药污染，是典型的绿色食品，具有广阔的开发前景。

鉴于此，本研究以笃斯越橘果实为原材料，探索超声波辅助法用于从笃斯越橘果实中提取花青素的工艺，提高花青素得率，同时测定pH值、氧化剂、还原剂、金属离子、光等因素对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响，为笃斯越橘果实花青素的生产、保存和应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

笃斯越橘果实：采自大兴安岭图强林场，东北农业大学植物教研室常缨教授鉴定。

乙醇、柠檬酸、盐酸、氯化钾、磷酸二氢钠、氢氧化钠、双氧水、抗坏血酸、氯化钙、氯化镁、氯化锌、硫酸铜、氯化铝（分析纯）：天津市巴斯夫化工有限公司。

1.2 仪器与设备

超声波仪：宁波新芝生物科技股份公司；HWS28型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计：岛津有限公司；PB-10型数显pH计：sartorius公司。

1.3 试验方法

1.3.1 笃斯越橘果实花青素提取

分别称取3 g笃斯越橘果实干果研细置于三角瓶中，按表1 L9（34）正交试验水平表添加浸提液（酸化乙醇），超声波处理20min而后水浴2 h，过滤保存滤液，滤渣置于原三角瓶中，相同条件水浴1 h再次提取，抽滤，合并两次滤液。每处理重复3次。

表1 正交试验因素水平表Table1 Theorthogonalexperiment factors level

1.3.2 笃斯越橘花青素的提取率测定

采用双波长pH值示差法[17]，取待测液1mL，分别加入KCl-HCl缓冲溶液（pH 1.0，0.25mol/L）或NaH2PO4-柠檬酸缓冲溶液（pH3.0，0.20mol/L）9mL，摇匀，转入光路长为1 cm的比色皿中，静置。5min后以缓冲溶液为空白对照，518 nm波长处测定光密度（opticaldensity，OD）。

式中：E=（ODpH1.0-ODpH3.0）样×V/W，V为浸提滤液体积，mL；W为样品的质量，g；C为标样浓度，（mg/ mL）；ΔA=（ODpH1.0-ODpH3.0）标。因C/ΔA为恒量，故本研究以E值大小衡量花青素的相对提取率。

1.3.3 pH值对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响

分别用pH值为1.2、3.2、5.2、7.2、9.2、11.2缓冲溶液稀释一定量提取液，测定518 nm不同pH值条件下吸光度，并观察稀释液颜色变化情况。

1.3.4 氧化剂对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响

取一定量提取液，加入30mL 1mmol/L双氧水溶液稀释，摇匀静置，每10分钟测定吸光度，测定波长518 nm。

1.3.5 还原剂对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响

取一定量提取液，分别加入等体积浓度为0.5、1.0、1.5mmol/L抗坏血酸溶液稀释，测定518 nm吸光度。

1.3.6 金属离子对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响

取一定量提取液，分别加入10mL浓度为0.1%，pH值为3.0 Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Al3+的溶液稀释，摇匀后静置10min，分别测定518 nm溶液的吸光度。

1.3.7 光照对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响

取一定量提取液，分别放置于室外自然光、室内自然光、暗室0、2、4、6 d，取样，测其518 nm吸光度。

2 结果与分析

2.1 笃斯越橘果实花青素提取

对笃斯越橘果实花青素提取研究正交试验结果的极差分析见表2。

表2 L9（34）正交试验结果表Table2 The resultsof L9（34）orthogonal test

可以看出：温度、料液比、超声波功率、醇浓度这4个因素对笃斯越橘果实花青素含量均有一定影响。影响的主次顺序分别为超声波功率>醇浓度>料液比>温度；试验得到最优提取方案为T1V2P2C2组合，即提取温度40℃，料液比3∶40（g/mL），超声波功率200W，提取醇浓度75%。

2.2 验证试验

从表2正交试验依据E值获得最优提取方案为T1V2P2C2组合即提取温度40℃，料液比3∶40（g/mL），超声波功率200W，提取醇浓度75%组合，而依据k值最优组合T1V1P2C1组合即提取温度40℃，料液比3∶30（g/mL），超声波功率200W，提取醇浓度65%组合；对上述两组合进行验证试验，3次验证试验T1V2P2C2组合平均实际E值为9.33，而T1V1P2C1组合平均实际E值为9.41，由此确定最佳的提取组合为T1V1P2C1组合即提取温度40℃，料液比3∶30（g/mL），超声波功率200W，提取醇浓度65%，与正交试验结果吻合。

2.3 pH值对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响

pH值对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响花见表3。

表3 pH值对笃斯越橘果实花青素颜色的影响Table3 Effectsof pH on the color of anthocyanin

花青素受pH值变化影响较大，不同pH值条件下，笃斯越橘花青素溶液呈现肉眼可辨的色泽变化，在酸性条件下呈现红色至粉色的变化趋势；中性条件下变成蓝紫色，碱性条件下再次转为黄绿色。

pH值对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响花见图1。

图1 pH值对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响Fig.1 Effectsof pH on the stability ofanthocyanin

处理的吸光值变化幅度较大。pH值为1.2～5.2时，随pH值的增加吸光值逐渐减小；pH值为7.2吸光值迅速回升，而后下降。pH值对笃斯越橘果实花青素色泽稳定性影响较大，因此在花青素的利用上要考虑制品的pH变化带来的色泽改变。

2.4 氧化剂H2O2对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响

氧化剂H2O2对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响见图2。

图2 氧化剂H2O2对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响Fig.2 Effectsof oxidantsH2O2on thestability of anthocyanin

笃斯越橘果实花青素提取液中加入1mmol/L双氧水后，色泽变化明显，其吸光度也呈现明显的下降趋势，这表明提取液对氧化剂的耐受性不强，极易发生直接或间接的氧化反应，导致化学组成变化，原有色泽被破坏，因此在加工利用过程中，应尽量避免与氧化剂的直接接触。

2.5 抗坏血酸对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响抗坏血酸对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响见图3。

图3 抗坏血酸对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响Fig.3 Effectsof reducing agenton thestability of anthocyanin

不同浓度抗坏血酸引起笃斯越橘果实花青素的吸光值变化并不显著，显然还原性环境有利于花青素稳定，由此说明还原剂对笃斯越橘果实花青素稳定性影响不大。

2.6 金属离子对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响

金属离子对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响见图4。

图4 金属离子对笃斯越桔果实花青素稳定性的影响Fig.4 Effectsofm etal ion on the stability of anthocyanin

提取物在pH=3.0浓度为0.1%的各试验金属离子的溶液中吸光值变化不显著，由此说明笃斯越橘果实花青素在试验条件下对Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Al3+相对稳定。

2.7 光对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响

提取液分别放置在室外自然光、室内自然光、暗室3种光照条件6 d后，目测观察到室内自然光、暗室处理条件下，提取液的颜色无明显变化，而在室外自然光处理提取液由亮红色变为亮橙色，颜色变化较为明显大。光对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响见图5。

图5 光对笃斯越橘果实花青素稳定性的影响Fig.5 Effectsof lighton the stability of anthocyanin

提取液吸光值在室外自然光照条件放置两天即与对照呈现极显著差异，而室内自然光和暗室条件下放置的样品吸光值变化差异不显著。由此可见笃斯越橘果实花青素提取液对较强的光线直射不稳定，成分与色泽均有较显著的变化，而弱光和避光条件有利于样品的保存，因此在加工制品的包装与产品的储运过程中，应充分考虑光照条件对产品的影响。

3 结论

1）通过利用超声波辅助，对笃斯越橘果实花青素进行提取，对温度、料液比、超声波功率和醇浓度进行正交试验，确定了最佳提取条件。结果为：最佳提取温度为40℃，最佳料液比为3∶30（g/mL），最佳超声波功率为200W，最佳提取液浓度为65%的酸化乙醇。

2）对笃斯越橘果实花青素的稳定性研究结果表明：笃斯越橘果实花青素提取液对pH值敏感；氧化剂H2O2对笃斯越橘果实花青素提取液稳定性影响较大；还原剂抗坏血酸对笃斯越橘果实花青素稳定性影响较小；在pH值为3.0时笃斯越橘果实花青素提取液对Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Al3+较稳定；笃斯越橘果实花青素提取液对室外自然光照射稳定性较差保存过程中应尽量采取避光措施，以免影响产品品质。

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Extraction and Determ ination of Stability of Anthocyanin from the Fruit of Vaccinium uliginosum L.

LIYang-yang，PENGKan-kan，YANG Jiu-shuang，JUAn-ji，XU Yong-qing*
（Collegeof Life Science，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

This research was aimed to determine the best condition for extracting anthocyanin from fruits of Vaccinium uliginosum L.with orthogonalexperimentaldesign by the ultrasound-assisted ethanolextraction process.Itwas determined that the optimum extraction temperature was 40℃，the optimum material liquid ratio was 3∶30（g/mL），the optimum ultrasonic powerwas 200W and the optimum extraction condition was 65% acidified ethanol.The resultofdetermination ofstability ofanthocyanidin from the fruitof Vaccinium uliginosum L.showed that：anthocyaninwassensitive to pH；oxidanthad larger impacton the stability ofanthocyanin；reducingagenthad littleeffecton the stability ofanthocyanin；when the pH was3.0，anthocyanin from the fruitof Vaccinium uliginosum L.toCa2+，Mg2+，Zn2+，Al3+，Cu2+wasmorestable；ithad better stability on indoornatural lightand dark，and poorstability on outdoornatural light.

Vaccinium uliginosum L.；anthocyanin；extraction；stability

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.011

2016-09-12

国家基础科学人才培养基金子课题资助项目（J1210069）作者简介：李阳阳（1993—），女（汉），学士，研究方向：生物化学与分子生物学。

*通信作者：徐永清（1977—），女，副教授，博士，研究方向：资源植物学与植物次生代谢产物代谢。