基于高通量测序的肉牛垫料养殖床中细菌群落分析

周德平 褚长彬 赵 峥 姜震方 吴淑杭*(上海市农业科学院生态环境研究所 0403；上海东保农业科技有限公司，上海市闵行区 006)

基于高通量测序的肉牛垫料养殖床中细菌群落分析

周德平1,2褚长彬1赵 峥1姜震方1吴淑杭1*(1上海市农业科学院生态环境研究所 201403；2上海东保农业科技有限公司，上海市闵行区 201106)

利用Roche 454GSFLX+高通量测序平台分析了肉牛垫料养殖床中的细菌群落结构，结果显示，从发酵床样品中共获得17 772条有效序列，其中优质序列有13 301条，在97%相似水平上聚为1 603个OTU分类单元；目水平上，细菌优势种群集中在芽孢杆菌目（21.70%）、红螺菌目（18.20%）、乳杆菌目（14.90%）、梭菌目（14.10%）、黄杆菌目（10.50%）、伯克氏菌目（5.50%）、黄单胞菌目（3.00%）、放线菌目（2.10%）和根瘤菌目（1.80%）；属水平上，细菌的优势种群主要集中于醋酸杆菌属（15.17%）、金黄杆菌属（9.50%）、乳杆菌属（6.90%）、芽孢杆菌属（6.30%）、乳球菌属（6.0%）、高温放线菌属（3.50%）、类芽孢杆菌属（2.40%）、梭菌目（2.10%）、伯克氏菌属（2.10%）和葡萄糖醋杆菌属（1.80%）。

垫料养殖；肉牛；细菌种群结构；高通量测序

有关研究表明，一头泌乳牛日平均排泄粪便32.1 kg、尿20.2 kg，按此计算，一家千头奶牛场的年均粪便产生量为11 717 t、尿7 373 t左右，由此对周边环境造成了巨大压力。目前，上海地区奶牛场配套的粪尿处理设施主要为沼气发酵，但其本身作为一种能源工程，产生的沼渣、沼液也需进行合理的处置，而目前所面临的现状是海量的沼液无处可排，对周边农田生态系统和水环境产生了较大威胁。垫料养牛技术是利用牛棚中铺设的垫料基质中功能微生物群落对粪尿进行降解和消纳，并利用翻耙设备定时将表面的粪尿与垫料混合，该技术不仅实现了粪尿的自然降解，还可改善养殖环境。

为明确肉牛垫料养殖中的细菌群落组成，以生产中稳定运行2年的肉牛发酵床的垫料基质为研究对象，利用Roche 454 GS FLX+高通量测序平台，对发酵床基质中细菌16s V1-V3 区全长进行了测序、分析，以探寻其中的细菌群落结构组成，从而寻找出发挥功效的主要微生物种群。

1 材料与方法

1.1 样品来源

试验用的肉牛发酵床基质来源于上海牛奶集团的跃一奶牛养殖场，在实际养殖过程中已稳定运行2年，基本实现粪尿不外排。

1.2 目标序列、所用引物及分析用数据库

细菌分析16s V1～V3 区全长，rDNA 通用引物序列为：

融合引物为：

细菌OUT聚类分析用Greengene数据库信息。

2 结果与分析

图1 细菌优质序列长度分布

图2 肉牛发酵床中主要细菌优势种群分布（目水平）

2.1 序列数分析

经454焦磷酸测序后，从样品中共获得细菌群落17 772条有效序列，其中优质序列有13 301条，优质序列的长度主要分布在440～540 bp的范围间（见图1），可满足对细菌属种水平分类信息的需求。

表1 肉牛发酵床中主要细菌优势种群比例分析（属水平）

2.2 目水平上，肉牛发酵床中细菌优势种群分析

OTU（Operational Taxonomic Units 操作分类单元）是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于分析，人为给某一个分类单元（品系、属、种、分组等）设置的同一标志。将序列按照一定的相似性归为许多分类单元，1个单元就是1个OTU。本研究对优质序列按相似度0.97进行聚类，以每个类最长的序列为代表序列，在Greengene(Release 13.8 http://greengenes.secondgenome.com/)数据库的基础上，采用blast方法对序列进行比对分析，获得每个OTU的分类信息。

对目标样品中获得的13 301条优质序列进行聚类，共获得1 603个细菌OTU分类单元。在目水平上，细菌优势种群的分布（见图2）。其中芽孢杆菌目（Bacillales）的比例最大，占细菌群落的21.70%，其次为红螺菌目（Rhodospirillales），为18.20%，接下来依次为乳杆菌目（Lactobacillales）14.90%、梭菌目（Clostridiales）14.10%、黄杆菌目（Flavobacteriales）10.50%、伯克氏菌目（Burkholderiales）5.50%、黄单胞菌目（Xanthomonadales）3.00%、放线菌目（Actinomycetales）2.10%、根瘤菌目（Rhizobiales）1.80%等。

2.3 属水平上，肉牛发酵床中细菌优势种群分析

在属水平上，肉牛发酵床中细菌优势种群的分布（见表1）。其中种群比例最大的为醋酸杆菌属（Acetobacter），占整个群落中的15.17%；其次为金黄杆菌属，为9.50%；然后依次为乳杆菌属6.90%、芽孢杆菌属6.30%、乳球菌属6.0%、高温放线菌属3.50%、类芽孢杆菌属2.40%、梭菌目2.10%、伯克氏菌属2.10%、葡萄糖醋杆菌属1.80%等。

3 小 结

分析结果表明，对肉牛发酵床垫料基质样品进行高通量测序后共获得13 301条优质序列，在97%相似水平上，所获全部优质序列共聚为1 603个OTU分类单元。在细菌分类中，目水平上，肉牛发酵床垫料基质中主要的细菌优势种群集中在芽孢杆菌目（21.70%）、红螺菌目（18.20%）、乳杆菌目（14.90%）、梭菌目（14.10%）、黄杆菌目（10.50%）、伯克氏菌目（5.50%）、黄单胞菌目（3.00%）、放线菌目（2.10%）和根瘤菌目（1.80%）；属水平上，肉牛发酵床垫料基质中主要的细菌优势种群集中于醋酸杆菌属（15.17%）、金黄杆菌属（9.50%）、乳杆菌属（6.90%）、芽孢杆菌属（6.30%）、乳球菌属（6.0%）、高温放线菌属（3.50%）、类芽孢杆菌属（2.40%）、梭菌目（2.10%）、伯克氏菌属（2.10%）和葡萄糖醋杆菌属（1.80%）。

2016-05-27

崇明区科技攻关项目（编号：CK2014-11）。

*为通讯作者。