外源性一氧化碳对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡状况的影响

李运成 贺斌峰 钱桂生 王关嵩



·论著·

外源性一氧化碳对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡状况的影响

李运成1贺斌峰2钱桂生2王关嵩2

目的研究外源性一氧化碳对大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC)凋亡状况的影响，探讨低氧肺血管重建的发病机制及防治措施。方法复合胶原酶法培养动脉平滑肌细胞，分别给予常氧、低氧、低氧合并低浓度一氧化碳处理。采用透射电镜、流式细胞仪、逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、免疫组织化学染色等方法检测肺动脉平滑肌细胞的凋亡状况及caspase-3表达水平。结果电镜观察可见，低浓度一氧化碳处理PASMC后呈凋亡样改变，染色质浓缩成块状位于核周边，细胞核边集近似半月型，细胞器结构完整。流式细胞仪示，正常培养PASMC没有明显的亚二倍峰，低氧24 h条件下可见亚二倍峰，低浓度一氧化碳处理24 h后，PASMC亚二倍峰明显升高。RT-PCR和免疫组织化可见，低浓度一氧化碳作用后caspase-3的mRNA和蛋白水平显著升高。结论低浓度一氧化碳可以调节caspase-3基因的表达，从而促进肺动平滑肌细胞的凋亡。

低氧性肺动脉高压； 一氧化碳； 平滑肌细胞； Caspase-3

低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是一种临床常见病症，病因复杂，可由多种心、肺或肺血管疾病引起。肺血管重建被认为是低氧肺动脉高压的主要病理变化[1]，主要表现为动脉中膜肌层增厚 ,平滑肌细胞由收缩型变为合成型，肥大增殖。在上述病理过程中，平滑肌细胞凋亡减少而增殖增加[2]。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)是肺血管壁的主要组成部分，增加平滑肌细胞凋亡可以逆转肺动脉高压肺血管重建[3]。caspase-3在细胞凋亡调控中居中心地位，在凋亡发生过程中发挥重要作用。一氧化碳(carbon monoxide, CO)是一类新的信使分子和血管舒张因子，作用与一氧化氮(nitro oxide, NO)有相似之处。以往体外研究发现，低氧可以促进PASMC的增殖，而低浓度CO可以部分抑制低氧对PASMC的作用[4]。为深入探讨其机制，本研究利用复合胶原酶法培养肺动脉平滑肌细胞，分别为给予常氧、低氧、低氧合并低浓度CO处理，观察PASMC的凋亡状况和caspase-3基因的变化，探讨HPH发病机制，为其防治提供新的思路。

材料与方法

一、PASMC的培养和处理

采用复合胶原酶法培养PASMC，参照文献[5]方法进行。参照文献[6]方法，应用低浓度CO和低氧气体处理PASMC 24 h，另取正常细胞作对照。即分为正常组、低氧24 h组、低氧合并低浓度CO 24 h组。

二、超微结构观察

将低浓度CO和低氧处理的细胞离心成团，用戊二醛固定，4 ℃保存后送电镜室，再用环氧树脂包埋，制成超薄切片，于透射电镜下观察。

三、流式细胞仪检查

分组培养24 h 后，离心收集实验组及空白对照组细胞，按照AnnexinV-FICT试剂盒说明书处理待检细胞，然后上流式细胞仪进行检测。

四、逆转录聚合酶链式反应

上游引物5′-ATG GAC AAC AAC GAA ACC TCC GTG-3′下游引物5′-CCA CTC CCA GTC ATT CCT TTA GTG-3′，扩增目的片段为854 bp。阳性对照为 HPRT，上游引物5′- GCT GGT GAA AAG GAC CTC TCG- 3′，下游引物5′-GCA GAT GGC CAC AGG ACT AGA-3′，扩增的目的片段长度为258 bp。95 ℃ 4 min后加入Taq DNA聚合酶而后94 ℃ 50 s，63 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 35个循环，未次延伸时间72 ℃ 10 min。最后用10 μl PCR产物进行电泳、摄像、存入计算机，并用复旦四星的 SX-IMAGE图像分析系统进行光密度扫描。结果以caspase-3/HPRT的积分光密度比值表示。

五、免疫组织化学染色

Caspase-3一抗为兔抗鼠单克隆抗体，购自加德国宝灵曼公司，工作浓度1︰200；生物素标记的二抗为羊抗兔多克隆抗体，购自武汉博士德公司，工作浓度1︰200。具体方法参见[4]。结果判定:背景无颜色,胞浆内着棕黄色颗粒为阳性细胞。无阳性信号(-)；弱阳性(+), 阳性细胞<25%；弱阳性 (++)，阳性细胞25%～50%；强阳性(+++)，阳性细胞50%～75%；强阳性(++++)，阳性细胞>75%。

六、统计学方法

结 果

一、电镜观察结果

电镜下可见，低氧处理PASMC后有凋亡样改变；低浓度CO处理PASMC后凋亡样改变明显，染色质浓缩成块状位于核周边，即细胞核边集近似半月型，细胞器结构完整。

二、流式细胞仪检查结果

正常培养PASMC没有明显的亚二倍峰，凋亡率约3.0%；低氧24 h条件下可见亚二倍峰，凋亡率约10%；低浓度CO处理24 h后，PASMC亚二倍峰明显升高，凋亡率54%，见图1。

图1 流式细胞仪检查结果；注：A：常氧组；B：低氧组；C：CO组流式图

三、RT-PCR结果

逆转录聚合酶链式反应显示，caspase-3在常氧情况下有微量表达，低氧情况下表达升高，低浓度CO作用后显著升高见，见图2。

图2 RT-PCR检测caspase-3 mRNA表达情况；注：A：常氧组；B、C：低氧组；D：低浓度CO组

四、免疫组织化学染色结果

正常组PASMC caspase-3免疫组织化学染色很弱，阳性细胞约10%；低氧组caspase-3有所升高，阳性细胞约38.7%；CO组明显升高，阳性细胞约85.7%，与低氧组比较有显著差异(P<0.01)。

讨 论

近年来，随着细胞凋亡在肺动脉高压研究中的不断深人，人们已经注意到肺动脉高压时，肺组织细胞可以细胞凋亡方式出现，并在发病中起到一定作用。我们电镜观察发现，低浓度CO和低氧处理后，PASMC出现凋亡样改变，流式细胞仪也证实，低浓度CO处理后，PASMC凋亡率显著上升。实际上细胞凋亡可以发生于机体内很多正常组织，在增生缓慢的细胞群如前列腺和肾上腺皮质细胞等，以及在增长迅速的细胞群如小肠上皮细胞等，都出现凋亡现象。一方面，血管平滑肌细胞凋亡可能参与调节正常血管壁及新生内膜的形成。另一方面，在原发性高血压、动脉粥样硬化及冠状动脉成形术后再狭窄等疾病中，整体上血管平滑肌细胞表现为增殖活跃，但凋亡也随之明显增加[7]。传统认为凋亡细胞可见凋亡小体，我们的多次选送电镜标本少见典型的变化。

细胞凋亡是调节机体组织平衡的重要机制，其过程受到严密的控制，而caspase(cysteinylaspartate specific proteinase)蛋白酶家族在细胞凋亡发生过程中的个阶段都发挥重要作用，caspase是指一群含有半胱氨酸的蛋白酶，目前研究发现至少有14种caspase家族成员，其中caspase-3是最重要成员，引起细胞凋亡的最下游成分，是细胞凋亡的效应分子。caspase引起细胞凋亡的途径通常为死亡受体接受死亡信号，引起上游procaspase-8的激活，导致caspase-9激活，最终导致caspase-3激活。caspase-3通过破坏细胞核纤层，直接导致细胞结构的破坏，使细胞凋亡。目前对于caspase-3在肺动脉平滑肌细胞中的表达特点及临床意义尚不十分清楚。我们应用RT-PCR发现，低氧处理后PASMC的caspase-3 mRNA表达水平升高，低浓度CO处理后的caspase-3 mRNA表达水平显著升高。免疫组化可见两种情况下，PASMC蛋白质含量均增加，后者增加更显著。caspase-3是凋亡早期表达的基因，灵敏性高，检测其表达状态具有重要意义。

多年来，CO被认为是一种可以致命的毒性气体。1968年人们已认识到机体可以产生内源性的CO，血红素氧合酶是内源性CO产生的限速酶。上个世纪九十年代，随着一氧化氮作为一种气体信使分子的作用被逐渐了解，同为气体小分子的CO，在体内的生理作用也逐渐得到重视，CO成为继一氧化氮之后第二种被发现有病理生理作用的气体信使分子。近年来的研究发现，CO参与了机体内许多的生理和病理生理过程，在机体内发挥了重要的保护作用。但是对组织细胞的保护机制不尽相同，研究报道在内皮细胞中、在内皮细胞中及胰岛的β细胞中，CO发挥了抗凋亡作用[8-17]。CO对PASMC是否有促凋亡作用，目前还不清楚。但已经证实，CO能够抑制低氧诱导的大动脉平滑肌细胞的增殖，从而在血管重建中发挥作用[18]。有研究发现NO供体硝普钠盐刺激兔后，可诱导PASMC凋亡，其中caspase-3的活性上升，mRNA水平升高[19]。CO和NO的性质类似，该研究从一个方面证实了我们的结论。

增殖和凋亡现象共存在于低氧肺动脉高压大鼠的肺血管细胞中，也许某些凋亡基因的异常表达导致了细胞增殖和凋亡的失衡，进而调节了慢性低氧肺血管结构的改建。本实验提示caspase-3可能参与了肺动脉组织的凋亡，而CO对caspase-3基因有调节作用，caspase-3在PASMC表达程度对于评估肺动脉高压患者的预后及指导临床治疗有一定意义。

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(本文编辑：张大春)

李运成，贺斌峰，钱桂生，等. 外源性一氧化碳对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡状况的影响[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2016， 9(5)： 494-497.

WangGuansong,Email:wanggs2003@hotmail.com

Objective To investigate the influence of low-dose carbon monoxide on the expression of caspase-3 in rat pulmonary artery smooth muscle cells(PASMC), and explore the pathogenesis and prenvention measures of pulmonary vasccular remoding. Methods The PASMCs of rats were cultured in normal O2, hypoxia, combined hypoxia and carbon monoxide condition. Electronmicroscope, flow cytometry, reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and immunohistochemistrycal methods were used to detect the expression of the caspase-3 in rat pulmonary artery smooth muscle cells. Results In the PASMCs of rats cultured in combined hypoxia and carbon monoxide condition, the typical morphological changes of apoptosis were observed under transmission electronmicroscope, such as chromatin condensation and aggregation at the nuclear periphery, and nuclear fragmentation as well. The flow cytometer showed that typical apoptosis peak appeared in combined hypoxia and carbon monoxide condition, however, it was not obvious in hypoxia and normal O2condition. Caspase-3 mRNA and protein expression were significantly increased in combined hypoxia and carbon monoxide condition compared with those in hypoxia and normal O2condition. Conclusion Low concentration of carbon monoxide can regulate the expression of caspase-3, thereby promoting apoptosis of pulmonary artery smooth muscle cells.

Hypoxic pulmonary hypertension; Carbon monoxide; Smooth muscle cells; Caspase-3

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.005

国家自然科学基金资助项目(81370168) 蚌埠市科技计划项目[(2004)10]

233000 蚌埠市第一人民医院呼吸科1400037 重庆，第三军医大学新桥医院全军呼吸内科 研究所2

王关嵩，Email: wanggs2003@hotmail.com

R322.1+2，R329-3，R543.2

A

2015-09-15)

Effects of low-dose carbon monoxide on expression of caspase-3 in rat pulmonary artery smooth muscle cellsLiYuncheng1,HeBinfeng2,QianGuisheng2,WangGuansong2.1DepartmentofRespiration,FristPeople′sHospitalofBengbu,Bengbu233000,China;2InstituteofRespiratoryDiseases,theSecondAffiliatedHospitaloftheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China