肝素钠粗品及原料药中猪源性成分的聚合酶链式反应检测

余 燕，邓 锋

（广东省食品药品检验所，广东 广州 510180）

肝素钠粗品及原料药中猪源性成分的聚合酶链式反应检测

余 燕，邓 锋

（广东省食品药品检验所，广东 广州 510180）

目的 建立肝素钠粗品及原料药的聚合酶链式反应（PCR）检测方法，用于检测生产原料的动物来源是否为猪源性。方法 分别对肝素钠粗品及原料药进行了DNA提取，并加入猪特异性引物进行扩增，对扩增产物进行酶切及测序验证。结果 7批粗品及原料药中，只有粗品检测出猪源性成分，其DNA 50倍稀释液中均检测出猪源性成分，肝素钠PCR产物与Genbank中猪序列的同源性为99．2%。结论 用常规PCR方法检测肝素钠粗品及样品中猪源性成分是可行的。

肝素钠；猪源性成分；DNA片段；聚合酶链式反应扩增

肝素钠是黏多糖硫酸酯类抗凝血药，是由猪或牛的 肠黏膜提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属黏多糖类物质。近年来研究证明，肝素钠还有调血脂作用。早期的肝素钠药物常以牛、猪或羊的肠黏膜作为原料[1]，自从疯牛病被确诊后及羊瘙痒病的出现，许多国外厂商就不再采购牛和羊来源的肝素钠，只采购猪来源的肝素钠。而不同动物种属提取的生物大分子，可能会在分子结构、有关物质及疫病风险上存在差异，进而影响药品的疗效和毒副作用[2]，因此区分不同种属来源的肝素钠也显得非常重要。

动物源性成分检测方法有显微组织检测法、酶联免疫吸附测定（ELISA）法、近红外光谱检测法和分子生物学检测法等[3－7]。目前，在饲料行业和出入境检验检疫部门，先后制订的一系列标准均是基于核酸检测法。对肝素钠粗品基源的检测，实际上是对猪、牛及山羊、绵羊等基因的检测。线粒体DNA（m tDNA）控制区又称D环区，是m tDNA的非编码区，其碱基替换速率相对较快，是其他区段的5～10倍，被广泛应用于种群遗传学分析、物种鉴别及濒危物种保护等方面的研究[8－12]。因此，本研究中拟采用聚合酶链式反应（PCR）法来鉴别肝素钠粗品及样品的动物源性，现报道如下。

1 材料、仪器与试药

1．1 材料

猪肉粉阳性对照品、羊肉粉阳性对照品、牛肉粉阳性对照品（批号均为20131012）均由上海上海食品药品检验所所提供；3批肝素钠粗品（批号为 130901，130902，130904）由烟台东城生化股份有限公司提供；4批肝素钠原料药（批号为 130701，130702，130703，20101101）由北京赛而生物药业有限公司提供。

1．2 仪器

GE公司 Ultrospec 2100型核酸蛋白快速测定仪；Gene Amp®PCR System 9700型核酸扩增仪；Bio－rad DNA凝胶电泳仪Mini－Sub Cell GT；Bio－rad凝胶成像系统GelDoc 2000。

1．3 试剂

猪、牛、羊引物由上海生工生物工程公司合成；扩增反应液为Takara公司的Premix Taq；提取试剂盒分别为DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products（Takara公司），北京天根生物技术有限公司生产的土壤基因组提取试剂盒（货号为 DP336－02）；DNA marker（包括DL2000及20bp DNA laddermarker，大连宝生物工程有限公司）；MnlⅡ酶（纽英伦生物技术公司公司）；水为自制灭菌Milli－Q纯净水。

2 方法与结果

2．1 方法

2．1．1 猪、羊、牛肉粉阳性对照品DNA的提取

分别称取猪、羊、牛肉粉阳性对照品10mg，用提取试剂盒DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products按试剂盒说明书进行DNA提取。

2．1．2 肝素钠粗品及样品DNA的提取

采用北京天根生物技术有限公司生产的土壤基因组提取试剂盒，称取样品10mg，按照DNA提取操作说明书对7批肝素钠粗品及原料肝素钠中残留的DNA进行提取纯化。

2．1．3 引物序列

参考国家标准（标准号：GB／T 21101－2007动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法）及出入境检验检疫行业标准（标准号：SN／T 1119－2002进口动物源性饲料中牛、羊源性成分检测方法PCR方法）中的引物和DNA序列，与美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站（网址：www．ncbi．nlm．nih．gov）基因数据库中的猪、牛及羊线粒体基因进行了比对。最终设计的引物如下。

上游引物：GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA；

下游引物：ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG；

扩增片段大小为212 bp。

2．1．4 PCR检测

以提取阳性对照和肝素钠粗品及原料药为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系50μL：PreMix Taq 25μL，引物各1μL（10 mmol／L），DNA模板1μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35个循环；72℃再延伸5min。电泳条件：电压90 V，时间30min，用Gel red染色10min，置于成像系统观察电泳结果。

2．1．5 PCR产物的酶切及序列比对

酶切条件：按MnlⅡ酶的酶切反应条件操作。PCR产物送大连宝生物工程有限公司公司测序。用DNAstar软件进行同源性比对，将猪源性PCR产物序列与NCBI基因数据库中猪序列（NC_000845）比对。

2．2 结果

2．2．1 引物的特异性

采用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，结果显示，用猪的引物，以猪肉粉阳性对照的核酸为模板，可扩增出212 bp的特异条带，而以羊、牛肉粉阳性对照的核酸为模板均未扩增出该条带，表明猪的引物能特异性扩增猪来源的核酸，见图1。

2．2．2 肝素钠粗品及样品检测结果

采用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，结果显示，用猪引物扩增，3批肝素钠粗品能扩增出特异性条带，而4批原料肝素钠不能扩增出特异性条带，见图2。

2．2．3 肝素钠粗品及样品稀释液检测结果

图1 猪源性引物PCR扩增产物电泳结果

图2 DNA提取液常规PCR产物琼脂糖电泳图

将肝素钠粗品及原料药进行50倍的稀释。用猪引物扩增，最终7批肝素钠粗品及原料肝素钠均能扩增出特异性条带。结果见图3。

图3 DNA稀释液常规PCR产物琼脂糖电泳图

2．2．4 PCR产物的限制性内切酶确证结果

将其中一批肝素钠粗品YTHS130901用猪引物扩增，将扩增产物用MnlⅡ酶切后，得到长度分别为196及16的2个片段，结果见图4。

2．2．5 引物比对

图4 PCR产物的限制性内切酶图谱

将其中一批肝素钠粗品YTHS130901用猪引物扩增，将扩增产物送予大连宝生物公司测序，将猪源性PCR产物序列与NCBI基因数据库中猪序列（NC_000845）比对。猪源性样品的同源性为99．2%。

3 讨论

本研究所采用的猪源性引物目标序列为猪线粒体中tRNAlys和ATP合成酶亚基8和亚基6（tRNAlys－ATPase8－ATPase6）基因，该基因序列在同种物种中保守，在不同物种中差异较大。从基因库查询结果来看，扩增目标序列与基因库中家猪（Sus scrofa）基因匹配度为100%；该目标序列与牛（Bos taurus）基因、山羊（Capra hircus）基因、绵羊（Ovis aries）基因的最高匹配度分别为73%，79%和76%，说明目标序列为家猪特有扩增目标序列。该序列为猪线粒体中tRNAlys和ATP合成酶亚基 8和亚基 6（tRNAlys－ATPase8－ATPase6）基因，该基因序列在同种物种中保守，在不同物种中差异较大。通过对猪阳性对照及7批次样品的检测，证实了该引物的可靠性。

值得注意的是，3批粗品的DNA提取液检测出猪源性成分，4批原料药的DNA提取液检测结果为阴性，7批粗品及原料药的DNA稀释液中均检测出猪源性成分。分析原因可能为：肝素钠是硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属多糖类物质，因多糖类物质对PCR反应具有较强的抑制作用，肝素钠原料药与肝素钠粗品相比，纯度较高，DNA残留量较少，且多糖的存在干扰了PCR反应，故原料药的DNA提取液检测结果为阴性，而将提取液稀释后检测结果为阳性，推测为DNA提取液中仍有多糖残留，而正是多糖的存在抑制了PCR反应。进行稀释后，多糖含量降低，抑制作用减弱，而DNA含量仍在检测限以上，因此检测结果为阳性。粗品中DNA残留量相对较多，提取液中的多糖不足以抑制PCR反应，因此也显示阳性结果。

综上所述，用常规PCR方法检测肝素钠粗品及样品中猪源性成分是合理和可行的。

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Identification of Porcine Derived M aterials in Heparin Sodium Crude Product and Drug Substance Sam p les by PCR

Yu Yan，Deng Feng
（Guangdong Institute for Food and Drug Control，Guangzhou，Guangdong，China 510180）

Objective To develop a PCR method for the identification of porcine derived materials in heparin sodium samples．M ethods DNA was extracted from heparin sodium samples prepared from crude product and drug substance．Then the DNA samples extracted were amplified with specific primers．PCR products were digested by enzyme and sequenced to verify the sequence identity．Results It was found that porcine derived materials were detected in crude products，and none detected in drug substances．But porcine derived materials were detected in 50 times dilutions of crude products and drug substances by PCR．PCR products amplified from porcine derived samples had 99．2% homologies to that of gene in the Genbank．Conclusion It is feasible to use PCR to identify porcine derived materials in heparin sodium crude product and drug substance．

heparin sodium；porcine derived materials；DNA fragment；PCR amplifi－cation

R927．11；R973＋．2

A

1006－4931(2016)04－0026－04

余燕（1980－），女，河南信阳人，硕士研究生，主管药师，研究方向为生化药物分析与PCR技术开发，（电子信箱）yuyan921124＠126．com。

20115－03－30；

2015－08－18)

广东省医学科研基金项目，项目编号：A2013158，B2014093。