SPE-HPLC-MS/MS测定粮食中玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇

刘拉平 刘朝霞 武 瑜 张晓荣 李爱华

(西北农林科技大学测试中心 农业部食品质量监督检验测试中心(杨凌)，杨凌 712100)

SPE-HPLC-MS/MS测定粮食中玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇

刘拉平 刘朝霞 武 瑜 张晓荣 李爱华

(西北农林科技大学测试中心 农业部食品质量监督检验测试中心(杨凌)，杨凌 712100)

建立了以乙腈-水(84∶16,v/v)为提取溶剂、正己烷萃取和HLB固相萃取(SPE)净化、水和乙腈C18反相色谱梯度洗脱、电喷雾负离子多反应监测模式(MRM)同时测定粮食中玉米赤霉烯酮(ZEN)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)2种物质含量的HPLC-MS/MS检测方法。结果表明， ZEN和DON检出限(以信噪比S/N=3计)依次为0.1 μg/kg 和2 μg/kg，定量限(以信噪比S/N=10计)依次为0.3 μg/kg 和6 μg/kg；两者线性范围分别为0.20～25 μg/L(相关系数r=1.000 0)和4.0～500 μg/L (相关系数r=0.999 9)；不同样品2种目标物3个水平的加标回收率在88.7%～102.3%之间，相对标准偏差(RSD)在2.4%～7.3%之间。应用该方法对所检小麦样品进行分析，结果均发现严重污染样品的2种目标毒素。

SPE HPLC-MS/MS 玉米赤霉烯酮(ZEN) 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON) 粮食

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)均为镰刀菌所产生的真菌毒素，普遍存在于霉变的玉米、高梁、小麦等粮谷类作物中，人和动物误食被该类毒素污染的粮谷类食物或其加工产品可以产生广泛的毒性效应[1-4]。很多国家都制定了粮谷类产品中ZEN和DON的限量标准[5-6]。我国现行标准规定谷物及其制品中ZEN及DON的限量指标为60、1 000 μg/kg[7]。

目前，粮谷中ZEN和DON的测定方法主要有薄层色谱法和酶联免疫法[8]、免疫亲和柱净化-荧光计法和液相色谱法[9-11]、液相色谱-串联质谱法[12]，相关文献资料还有气相色谱法[13-14]和气相色谱-质谱联用法[15-16]。薄层色谱法以及酶联免疫法为早期标准的测试方法，存在灵敏度低以及假阳性干扰等方法缺陷，目前应用较少。气相色谱法及其质谱联用方法涉及目标物质的衍生化处理，方法的稳定性较差，标准方法中很少采用。免疫亲和柱净化-荧光计法和液相色谱法采用特异性强的免疫亲和层析柱进行样品处理，样品净化效果好，方法灵敏度及准确度高，但该类方法所用免疫亲和柱耗材价格高昂，况且一次只能做一种真菌毒素，难以广泛应用。液相色谱-串联质谱法为近几年所采用的真菌毒素测定新方法，该方法具有很强的目标物质选择性和很高的灵敏度，样品处理要求相对较低，一般采用常规方法的样品前处理即可满足要求；但目前没有ZEN和DON同时测定的试验方法。固相萃取(SPE)技术为样品净化、富集最常用手段，在药物残留分析中应用广泛。本试验采用SPE净化并结合溶剂萃取净化，通过高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)分离检测，实现粮食中ZEN和DON 2种真菌毒素的同时分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-20AD 液相色谱仪：日本岛津公司；API4000 Q-TRAP质谱仪：美国AB SCIEX公司；V8漩涡混匀器：美国安胜公司。

ZEN、DON(标准品，纯度≥99%)：以色列FERMENTEK公司；美国Tedia公司；Oasis HLB(60 mg/3 mL)固相萃取柱。

1.2 样品及制备

选用小麦、玉米、荞麦、谷子样品(本实验室送检样品)，用高速万能粉碎机磨细并通过18目筛，样品瓶分装待用。

1.3 标准溶液配制

标准储备液：分别称取ZEN及DON各10 mg至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，得质量浓度为100 μg/mL的储备液，置-18 ℃保存。

标准工作液：分别吸取以上标准储备液各5 mL于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，得质量浓度为20.0 μg/mL的标注工作液，置-18 ℃保存。

混合标准工作液：取以上ZEN和DON标准工作液分别为0.25、5 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，得质量浓度依次为50、1000 μg/L的混合标准工作液。

标准系列工作溶液：取混合标准工作溶液，用50%(体积分数)甲醇水溶液或样品基质溶液逐步稀释，得质量浓度分别为0.2、1.0、5、10、25 μg/L(ZEN)和4、20、100、200、500 μg/L(DON)的标准系列工作液，备用。

1.4 样品前处理

准确称取(2.5±0.01) g样品于50 mL离心管中，加入25 mL乙腈/水(84∶16)，涡旋2 min，超声提取30 min，中间振摇2～3次；取出离心管，8 000r/min离心5 min，取5 mL上清液于10 mL离心管中，加入3 mL正己烷(乙腈饱和)振摇、静置分层，去除正己烷层；下清液于45 ℃氮气吹干，加入0.5 mL甲醇溶解，补加4.5 mL水稀释；过Oasis HLB柱(3 mL甲醇和3 mL水预先活化)，经5 mL水淋洗后，用2.5 mL甲醇洗脱，洗脱液加2.5 mL水稀释，0.45 μm膜过滤后，LC-MS/MS测定。

1.5 仪器条件

1.5.1 液相色谱条件

色谱柱：Shim-pack XR-ODS 75 mm×3.0 mm，2.2 μm；柱温：30 ℃；流动相：A相为水，B相为乙腈；梯度洗脱程序0～8 min，B相从10%升至95%，保持2 min，10～12 min回至初始比例保持5 min；流速0.3 mL/min；进样量10 μL。

1.5.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；电喷雾电压(IS)：-4 500 V；气帘气(CUR)压 力: 138 kPa (20 Psi)；雾 化 气(GS1)压力: 345 kPa(50 Psi)；辅助气(GS2)压力:345 kPa (50 Psi)；离子源温度(TEM)：500 ℃；检测方式：多反应监测(MRM)。ZEN母离子为m/z317.1，子离子为m/z273.0/186.9/174.9，其中317.1>174.9为定量离子对；去簇电压(DP)：-80 V；碰撞能量(CE)：-27.5V/-35.0V/-34.0V。DON母离子为m/z295.1，子离子为m/z264.9/246.9/137.8，其中295.1>264.9为定量离子对；去簇电压(DP)：-80V；碰撞能量(CE)：-16.5 V/-17.0 V/-23.0 V。碰撞室入口电压(EP)：-10 V；碰撞室出口电压(CXP)：-15 V。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

在流动注射状态下，用200 μg/L混合标准溶液分别在正离子和负离子2种模式下进行全扫描,结果表明2个化合物均在负离子状态下具有更高的响应值；对标准溶液酸化以增强正离子信号和碱化进行负离子扫描再次确认负离子响应的显著性。进一步对2个化合物[M-H]-母离子进行子离子扫描，并对锥孔电压、去族电压、碰撞能量等参数进行了优化。最终，2个化合物均选择丰度较高、干扰较小的3对离子进行MRM监测，其中丰度最高的离子作为定量离子。结合液相色谱条件，最后修正完成质谱分析的所有参数(见1.5.2)。

2.2 色谱条件优化

在LC-MS/MS分析中，色谱条件的选择既要考虑色谱分离的效果，又要兼顾待测组分的离子化效率。本试验在反相C18色谱和电喷雾负离子模式下，参照1.5.1梯度洗脱程序，考察了甲醇、乙腈2种不同的有机相配合3种不同水相(纯水、10 mmol/L乙酸铵和0.03%氨水)作为流动相的色谱行为。结果发现：甲醇、乙腈作为有机相，其目标物质的信号强度甲醇较乙腈稍有增加，但乙腈作为流动相具有较小的保留时间、更好的峰形，甲醇为有机相则分析时间延长，峰形拖尾扩展；而采用3种不同水相时，DON目标峰保留时间均一样，ZEN目标峰纯水与乙酸铵时间一致，氨水体系保留值则缩短，3种体系目标物信号强度以纯水体系为最优(见图1)。综合考虑目标物质信号强度及色谱分离度，选择乙腈和纯水作为流动相组合。

图1 不同流动相组成ZEN和DON总离子流图

2.3 样品前处理条件选择与优化

2.3.1 提取溶剂选择

ZEN可溶于碱性水溶液或乙醚、苯等非极性溶剂，DON易溶于水、甲醇等极性溶剂，2种化合物的性质有较大差异。现行标准及文献资料中ZEN的提取大多用乙腈+水(9+1)[12-13,17]、乙腈+水(84+46)[18-19]溶液，主要以有机相乙腈为主；DON的提取则多用水[10,20]、缓冲液和甲醇[14]、水+乙腈[21-22]等溶液，侧重于水提为主。考虑到DON在乙腈中也有很好的溶解度以及采用高有机相提取溶剂可显著减少粮食类样品中高含量水溶性大分子干扰物质，本试验直接选择乙腈+水(84+46)为提取溶剂进行研究，该提取溶剂对2种目标物质均有较好的提取效果，方法回收率高、重现性好。

2.3.2 净化条件优化

参照饲料中ZEN测定行业标准[18]和出口食品中DON测定行业标准[21]，对样品提取溶液采用正己烷脱脂初步净化；而后初步净化样品过Oasis HLB固相萃取柱进一步净化[21-22]。考虑到2种目标物质的极性不同，文献所述DON测定过萃取柱前样品用水溶解可能不能完全溶解ZEN[21-22]，利用水+甲醇混合溶液并增加甲醇比例有助于ZEN的溶解，但该溶液甲醇比例过高又会降低目标物在固相萃取柱上的保留。2种目标物溶解性及HLB固相萃取柱目标物保留特性的研究：取0.5 mL混合标准溶液3份，氮吹仪吹干，分别用纯水、水+甲醇(10+90)、水+甲醇(20+80)3种不同溶液均5 mL超声溶解，按1.4固相萃取步骤过柱净化；收集过柱样品溶液、水淋洗液、甲醇洗脱液(加2.5 mL水稀释)，过滤，测定。结果表明，纯水、水+甲醇(10+90)2种溶剂均能溶解目标组分并具有较好的萃取柱保留特性，2种目标物均集中出现在甲醇洗脱部分；水+甲醇(20+80)体系过柱，第一个组分DON随过柱样品即有部分流出(总量1/3左右)，萃取柱保留特性较差。选用水+甲醇(10+90)体系进一步做加标试验表明，由于提取样品中杂质成分的影响，脂溶性组分ZEN在样品吹干后溶解环节效果欠佳，致使该组分回收率偏低，故本环节最终优化为样品吹干后用0.5 mL甲醇溶解，然后加水4.5 mL稀释至水和甲醇比例为10∶90。

采用本净化方法，处理荞麦、谷子、玉米3份空白基质样品，采用基质加标(ZEN 2.5 μg/kg, DON 50 μg/kg)进行基质效应试验。结果表明，不同样品基质ZEN抑制率为6.0%～53.0%，DON为2.8%～26.3%(见表1)，2种目标物及不同样品基质效应均比较低，样品净化的效果较好。但比较而言，荞麦和谷子样品的基质效应更低，而玉米样品基质效应相对较高，这可能与样品中脂肪含量较高有关。由于不同样品的差异，考虑基质效应，采用空白样品基质溶液配制标准工作液进行实际样品的分析。

表1 基质效应试验结果

注：基质效应=(基质加标峰面积-溶剂标准溶液峰面积)/溶剂标准溶液峰面积×100%。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围、检出限与定量限

测定1.3节中标准系列工作溶液，绘制方法标准曲线；采用空白样品加标(ZEN 1.0 μg/kg、DON 20 μg/kg)，按色谱峰S/N≥3计算方法检出限、色谱峰S/N≥10计算方法定量限。ZEN在0.2～25 μg/L范围内线性关系良好，线性方程为Y=5.1×104X+346(r=1.000 0)，检出限、定量限依次为0.1、0.3 μg/kg；DON在4～500 μg/L范围内线性关系良好，线性方程为Y=3.02×103X-738(r=0.999 9)，检出限、定量限依次为2、6 μg/kg。2种目标物质的检出限、定量限均优于我国现行标准指标。

2.4.2 方法回收率和精密度

选用荞麦、谷子、玉米3个空白样品，按ZEN/DON添加浓度1.0/20、5.0/100、25/500 μg/kg 3个水平进行添加回收试验(依次编号为水平1、2、3)，每个水平3次重复。结果表明，ZEN平均回收率为88.7%～96.8%，相对标准偏差(RSD)为5.2%～7.3%；DON平均回收率为90.7%～102.3%，相对标准偏差(RSD)为2.4%～4.0%(见表2)。方法的准确度及精密度均达到现行相关标准指标及残留分析要求。

表2 不同水平加标试验回收率及相对标准偏差(n=3)

2.5 样品测定

应用本方法对本实验室的14个小麦、3个玉米、4个荞麦、6个谷子(小米)共计27个样品进行测定，其中小麦样品均检出ZEN(27.5～66.7 μg/kg)和DON(625～3545 μg/kg)，2种毒素检出率均为100%，超标率依次为14.3%、92.8%；玉米样品中检出1个ZEN(0.36 μg/kg)、2个DON(9.1、21.2 μg/kg)，检出率为33.3%、66.7%；荞麦样品检出1个ZEN(2.4 μg/kg)、2个DON(7.6、16.2 μg/kg)，检出率依次为25.0%、50.0%；谷子样品2种物质均未检出；以上玉米、荞麦、谷子样品2种毒素物质含量均未超标。我国多数地区气候湿润，小麦、玉米等极易受到霉菌污染，其中ZEN和DON的污染水平比较严重。资料表明，小麦、玉米样品中ZEN含量高达737 μg/kg，检出率范围在5.9%～100%；DON含量高达3737 μg/kg，检出率范围在47.6%～100%[23]。本试验中小麦、玉米2种毒素检出率与文献基本一致，但小麦DON的含量及超标率偏高，玉米中2种毒素含量与超标率偏低，这可能与样品的来源(同批样品)与样品作物本生长期病害发生的状况有关。

3 结论

本方法采用溶剂萃净化和固相萃取净化替代现行国家标准和行业标准中常用的免疫亲和柱及多功能净化柱净化方式进行样品前处理，通过液相色谱-串联质谱法进行含量测定，实现粮食类产品中ZEN和DON 2种真菌毒素的同时、快速分析。

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Determination of Zearalenone and Deoxynivalenol in Cereal Grains by SPE-HPLC-MS/MS

Liu Laping Liu Zhaoxia Wu Yu Zhang Xiaorong Li Aihua

(Testing Center, Northwest A&F University, Food Quality Supervision and Testing Center of Ministry of Agriculture (Yangling), Yangling 712100)

A method of SPE-HPLC-MS/MS was established for the content determination of ZEN and DON in cereal grains. The sample was extracted by acetonitrile-water (84∶16, v/v), and then purified by the methods of solvent extraction and HLB solid phase extraction (SPE). The chromatographic separation was performed on C18 column with gradient elution using acetonitrile and water as mobile phases, and the mass spectrometric acquisitions were carried out by means of multiple reaction monitoring (MRM) in electrospray negative ionization mode. The limits of detection (LOD, S/N=3) about ZEN and DON were 0.1 μg/kg and 2 μg/kg respectively, and the limits of quantification (LOQ, S/N=10) 0.3 μg/kg and 6 μg/kg respectively, and the ranges of linearity 0.20～25 μg/L(r=1.000 0) and 4.0～500 μg/L (r=0.999 9) respectively. The recoveries in different samples at three spiked concentration levels ranged from 88.7 % to 102.3 % with the relative standard deviations from 2.4 % to 7.3%.

SPE, HPLC-MS/MS, zearalenone (ZEN), deoxynivalenol (DON), cereal grains

O658

A

1003-0174(2016)04-0142-05

2014-08-02

刘拉平，男，1971年出生，高级实验师，农产品、食品质量安全检测