粗糙脉孢菌固态发酵产纤维素酶工艺优化

周正东，李学如

(西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031)

粗糙脉孢菌固态发酵产纤维素酶工艺优化

周正东，李学如

(西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031)

从青储饲料中分离得到一株产纤维素酶能力较强的丝状真菌，经形态学和26S rDNA D1/D2区序列比对分析，确认该菌株属粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)。通过单因素实验和正交实验探讨了碳源、氮源、无机盐、料水比、培养温度、培养时间对菌株固态发酵产纤维素酶的影响。确定最适产酶工艺为：碳源麸皮与稻草秆的质量比6∶4、氮源3%(NH4)2SO4、料水比1∶1.5(g∶mL)、培养温度30 ℃、培养时间60 h，无机盐KH2PO4和MgSO4对产酶影响不显著，在最适产酶工艺下，固态发酵产纤维素酶酶活达到251.27 U·g-1以上。

粗糙脉孢菌；纤维素酶；固态发酵

我国农作物秸秆年产量约9亿t，且呈不断增长态势[1-2]。常规的焚烧、填埋返田以及堆肥等处理方法存在环境污染严重和利用率低等弊端[2]。农作物秸秆的主要成分为纤维素和半纤维素，利用微生物或其产生的纤维素酶可将秸秆中不能被大多数生物利用的木质纤维素降解为可利用的低分子糖，从而为农作物秸秆生物质能量转化提供了一条有效途径[3]。此外，以秸秆为原料通过微生物发酵所产纤维素酶在酿造工业、饮料加工业、纺织工业、饲料添加剂等领域有着很高的应用价值[4]。研究表明，许多丝状真菌具有分泌纤维素酶和半纤维素酶的能力[5]，如粗糙脉孢菌产纤维素酶的能力与瑞氏木霉(Trichoderma)相近。林良才等[6]对粗糙脉孢菌降解木质纤维素的机制进行了较细致的分析。作者通过形态学和26S rDNA D1/D2区序列比对分析，对实验室前期从青储饲料中分离得到的一株产纤维素酶能力较强的丝状真菌进行鉴定，并以农作物秸秆为原料对该菌株固态发酵产纤维素酶的工艺进行优化，以期为产纤维素酶的粗糙脉孢菌的进一步开发利用奠定基础。

1 实验

1.1 菌种与培养基

粗糙脉孢菌NCL，从青储饲料中分离获得。

PDA液体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，自来水1 000 mL，自然pH值。

固态发酵培养基：250 mL三角瓶装料10 g干基质。碳源(麸皮、稻草秆、玉米秆、玉米芯)、氮源(硫酸铵、酵母膏、蛋白胨)、料水比等根据实验需求进行不同组合。

1.2 材料、试剂与仪器

麸皮、稻草秆、玉米秆和玉米芯等，采自成都温江等地；稻草秆、玉米秆和玉米芯均烘干粉碎过20目筛。

真菌DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、PCR纯化试剂盒等，Omega公司；四水合酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠、一水柠檬酸、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾等均为分析纯。

3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂：称取DNS 3.15 g，加水500 mL，搅拌3～5 s，水浴至45 ℃。逐步加入100 mL氢氧化钠溶液(200 g·L-1)，不断搅拌至溶液清澈透明。逐步加入四水合酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.5 g和无水亚硫酸钠2.5 g，继续45 ℃水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌直至完全溶解。停止加热，冷却至室温，用去离子水定容至1 000 mL。用烧结玻璃过滤器过滤，滤液储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7 d后使用，有效期180 d。

柠檬酸盐缓冲液(pH=5.5)：称取一水柠檬酸10.5 g、氢氧化钠5.0 g，加800 mL水溶解，调pH值至5.5，用去离子水定容至1 000 mL。

9902型PCR仪，美国Life Technologies公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；GeneGenius型全自动凝胶成像分析系统，美国UVP公司；V-1100D型可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；D3024R型高速冷冻离心机，美国赛洛捷克公司；ZHWY-2102C型恒温摇床，上海智城分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鉴定

形态学鉴定：在内置载玻片的PDA平板上接种一环粗糙脉孢菌，30 ℃培养3 d后取出载玻片，在显微镜下观察菌落、菌丝及孢子的形态。

26S rDNA分子鉴定：参照文献[7]稍做改进。将菌种接种于PDA液体培养基中，30 ℃摇瓶培养3 d，离心收集菌丝体，洗涤，加液氮研磨。按真菌DNA提取试剂盒操作步骤提取基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，然后用聚合酶链式反应(PCR)扩增26S rDNA的D1/D2区片段。PCR扩增的上游引物为：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-GG-3′，下游引物为：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR反应体系(50 μL)：DNA模板2 μL，PCR反应混合液25 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol)，补加ddH2O到50 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸5 min。

PCR扩增产物纯化与测序：按照PCR纯化试剂盒操作步骤纯化PCR产物。PCR产物的测序委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

序列比对及菌株的鉴定：输入菌株26S rDNA的D1/D2区片段测序结果，在NCBI数据库中进行同源性比对，鉴定菌株的种属。

1.3.2 菌株固态发酵

按麸皮与稻草秆质量比6∶4在250 mL三角瓶中装料10 g干基质，加入2% 硫酸铵、10 mL水，30 ℃培养24 h后扣瓶，继续发酵培养2 d后，取出发酵产物，40 ℃过夜烘干。

通过单因素实验和正交实验探讨碳源、氮源、无机盐、料水比、培养温度、培养时间对菌株固态发酵产纤维素酶的影响。

1.3.3 纤维素酶酶活的测定

葡萄糖标准曲线绘制：先用柠檬酸盐缓冲液配制10 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液，再稀释成0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1、1.8 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1系列葡萄糖标准溶液。分别吸取上述标准溶液各2.00 mL(2组平行)于刻度试管中，再分别加入2 mL水和2 mL DNS试剂，沸水浴5 min。自来水冷却至室温，用水定容至25 mL，测定540 nm处吸光度。以吸光度为横坐标、对应葡萄糖标准溶液含葡萄糖的毫克数为纵坐标绘制标准曲线，拟合得到线性回归方程：y=2.867x+0.080，R2=0.9980。

纤维素酶酶活测定：发酵结束，取样，烘干，按NY/T 912-2004[8]测定发酵产物中纤维素酶酶活。

酶活力单位定义：将37 ℃、pH值为5.5下，4 mg·mL-1羧甲基纤维素钠溶液每分钟降解释放1 μmol还原糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

2 结果与讨论

2.1 产纤维素酶菌株的鉴定

从青储饲料中分离得到一株产纤维素酶能力较强的丝状真菌，其在PDA平板上生长3 d的形态如图1所示。

菌落形态 菌丝及孢子形态(×200)

图1 菌株在PDA平板上的生长形态

Fig.1 Morphological images of the strain on PDA plate

由图1可知，菌株在PDA平板上呈扩散状生长，菌丝为疏松网状的长菌丝，在气生菌丝的顶部形成分枝链，分生孢子呈橘黄色，成熟的孢子呈串珠状排列(图1b)。这些形态特征与魏景超[9]的《真菌鉴定手册》和张妍妍等[10]描述的粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)形态相吻合。

将PCR扩增26S rDNA的 D1/D2区片段测序结果与NCBI数据库中序列进行BLAST比对分析，发现该菌株与数据库中的NeurosporacrassaEFB06相似度达100%。结合形态特征与26S rDNA分子鉴定，初步确认该菌株属粗糙脉孢菌，将其命名为NCL。

2.2 固态发酵产纤维素酶工艺优化

2.2.1 碳源对产酶的影响

纤维素酶是一种诱导酶，在以农作物秸秆为培养基基质的发酵过程中，农作物秸秆既是纤维素酶生长的碳源同时又是纤维素酶产生的诱导物。4种不同碳源对菌株产酶的影响如表1所示。

表1 4种不同碳源对菌株产酶的影响/(U·g-1)

Tab.1 Effect of four different carbon sources on enzyme-production/(U·g-1)

碳源稻草秆麸皮玉米秆玉米芯酶活201.56220.75138.9437.58

由表1可知，以稻草秆或麸皮为碳源时，粗糙脉孢菌NCL的产酶效果较好。

进一步考察两者质量比对菌株产酶的影响，结果见图2。

图2 麸皮与稻草秆的质量比对菌株产酶的影响

由图2可知，最适麸皮与稻草秆质量比为6∶4。麸皮比例适当可以促进产酶，当比例超过60%后酶活反而有所降低。这可能是因为，麸皮比例过高时，其含有的可溶性糖较高反而抑制了纤维素酶的产生[11]。

2.2.2 料水比对产酶的影响

确定培养基麸皮与稻草秆质量比为6∶4后，考察不同料水比(g∶mL，下同)对菌株产酶的影响。结果发现，当料水比为1∶1、1∶1.5和1∶2时，菌株产纤维素酶酶活分别为229.11 U·g-1、237.72 U·g-1和219.43 U·g-1，在料水比为1∶1.5时酶活最高，但三者之间差异不显著，表明粗糙脉孢菌NCL能在一个比较宽泛的料水比环境中产纤维素酶。因此，选择最适料水比为1∶1.5。

2.2.3 氮源对产酶的影响

采用L9(34)正交实验考察酵母膏、蛋白胨和硫酸铵3种氮源对菌株产酶的影响，结果见表2。进一步对实验数据进行方差分析，结果见表3。

由表2可知，发酵培养基的合适氮源组合为：1%酵母膏，2%蛋白胨，3%硫酸铵。从表3可看出，3种氮源对产酶的影响程度为：硫酸铵>蛋白胨>酵母膏，其中硫酸铵的影响程度远大于蛋白胨和酵母膏。考虑到显著性大小和实际生产成本，选取硫酸铵作为唯一氮源进行后续实验。

2.2.4 无机盐对产酶的影响

采用L9(34)正交实验考察(NH4)2SO4、KH2PO4和MgSO4对菌株产酶的影响，结果见表4。

由表4可知，KH2PO4和MgSO4的极差(R)与空白极差相近，表明培养基中添加KH2PO4和MgSO4对产酶影响不大；培养基中添加3%或4%的(NH4)2SO4对产酶影响十分接近。因此，粗糙脉孢菌NCL在 3%(NH4)2SO4作唯一氮源的培养基中能获得较好的产酶效果。

表2 氮源对产酶影响的正交实验结果

Tab.2 Results of orthogonal experiment for the effect of nitrogen source on enzyme-production

编号酵母膏%蛋白胨%硫酸铵%空白列酶活U·g-11001-186.682012-204.603023-217.744102-212.165113-214.956121-206.197203-212.968211-194.249222-217.74k1203.01203.93195.70206.46k2211.10204.60211.50207.92k3208.31213.89215.22208.05R8.099.9619.521.59

表3 方差分析

Tab.3 Variance analysis of orthogonal experiment

因素偏差平方和自由度F比显著性酵母膏101.43221.69*蛋白胨185.94239.76*硫酸铵644.122137.72**误差4.682

注:F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2，2)=99.00；*表示具有显著性；**表示具有极显著性。

2.2.5 培养温度对产酶的影响(表5)

表5 培养温度对产酶的影响

Tab.5 Effect of culture temperature on enzyme-production

温度/℃263034酶活/(U·g-1)211.36242.17243.88

由表5可知，26 ℃培养时酶活最低，30 ℃和34 ℃培养时酶活较为接近。因此，选择最适培养温度为30 ℃。

2.2.6 培养时间对产酶的影响

按麸皮与稻草秆质量比6∶4装料10 g干基质，加入3%(NH4)2SO4、15 mL水，在30 ℃下考察培养时间对菌株产酶的影响，结果见图3。

由图3可知，前24 h，酶活一直处于较低水平；24～36 h，酶活呈指数急速上升，这是因为，一方面菌丝体开始旺盛生长，另一方面是培养12 h后扣瓶使得发酵物的通气情况得到改善；60 h后，酶活趋于稳定。因此，选择最适培养时间为60 h。

表4 无机盐对产酶影响的正交实验结果

Tab.4 Results of orthogonal experiment for the effect of inorganic salt on enzyme-production

图3 培养时间对产酶的影响

2.3 菌株最适产酶工艺验证

在最适产酶工艺[麸皮与稻草秆质量比为6∶4、250 mL三角瓶装料10 g干基质、加入3%(NH4)2SO4作为氮源、添加15 mL水使料水比为1∶1.5、30 ℃培养60 h]下进行5批次粗糙脉孢菌NCL固态发酵产酶验证实验，发酵产物纤维素酶酶活都稳定在251.27 U·g-1以上。表明，本实验所得最适产酶工艺可行。

3 结论

经形态学和26S rDNA D1/D2区序列比对分析，确认从青储饲料中分离得到的一株产纤维素酶能力较强的丝状真菌属粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)。该菌产纤维素酶的最适工艺为：碳源麸皮与稻草秆质量比6∶4，氮源3%(NH4)2SO4、料水比1∶1.5(g∶mL)、培养温度30 ℃、培养时间60 h，在此工艺下，菌株产纤维素酶酶活达251.27 U·g-1以上。

[1] 毕于运,高春雨,王亚静,等.中国秸秆资源数量估算[J].农业工程学报,2009，25(12):211-217.

[2] 彭春艳,罗怀良,孔静.中国作物秸秆资源量估算与利用状况研究进展[J].中国农业资源与区划,2014,35(3):14-20.

[3] ZNAMEROSKI E A,GLASS N L.Using a model filamentous fungus to unravel mechanisms of lignocellulose deconstruction[J].Biotechnology for Biofuels,2013，6(1):1-7.

[4] 赵琪,李亚兰,陈子欣,等.纤维素酶应用研究的最新进展[J].广州化工,2014，42(6):21-23.

[5] SUN J,TIAN C,DIAMOND S,et al.Deciphering transcriptional regulatory mechanisms associated with hemicellulose degradation inNeurosporacrassa[J].Eukaryotic Cell,2012,11(4):482-493.

[6] 林良才,李金根,王邦,等.粗糙脉孢菌木质纤维素降解利用研究进展[J].生物加工过程,2014，12(1):28-36.

[7] 陈锋菊,李百元,杨冰,等.一种经济快速提取丝状真菌基因组DNA的方法[J].生命科学研究,2010，14(2):122-124.

[8] NY/T 912-2004,饲料添加剂 纤维素酶活测定[S].

[9] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979:198-199.

[10] 张妍妍,刘佩卉,刘新利.粗糙脉孢菌及其在发酵工业中的应用研究[J].山东科学,2011，24(3):37-42.

[11] 汪世华,胡开辉,杨燕凌.纤维素酶固体发酵条件的优化[J].河南科技大学学报(自然科学版),2006,27(1):65-66,69.

Optimization on Cellulase Production with Neurospora crassa by Solid-State Fermentation

ZHOU Zheng-dong，LI Xue-ru

(SchoolofLifeScienceandEngineering,SouthwestJiaotongUniversity,Chengdu610031,China)

A mycelial fungus with strong ability of producing cellulase was screened from ensilage and identified asNeurosporacrassaby the analysis of morphology and 26S rDNA D1/D2 sequence alignment.The effects of factors on producing cellulase withNeurosporacrassaby solid-state fermentation were investigated by a single factor experiment and an orthogonal experiment.The optimal fermentation conditions were as follows:the mass ratio of wheat bran to rice straw was 6∶4,nitrogen source was 3%(NH4)2SO4,material-water ratio was 1∶1.5(g∶mL),culture temperature was 30 ℃,culture time was 60 h,inorganic salt KH2PO4and MgSO4had no significant effect on cellulase production.The enzyme activity of produced cellulase reached up to above 251.27 U·g-1under above optimal conditions.

Neurosporacrassa;cellulase;solid-state fermentation

四川省科技支撑计划资助项目(2012FZ0048)

2016-06-22

周正东(1993-)，男，湖南龙山人，硕士研究生，研究方向：微生物技术，E-mail：1016992297@qq.com；通讯作者：李学如，教授，E-mail：xueruli@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.12.008

周正东，李学如.粗糙脉孢菌固态发酵产纤维素酶工艺优化[J].化学与生物工程，2016，33(12)：38-41，47.

TQ 352.78 TQ 920.1

A

1672-5425(2016)12-0038-04