银杏叶中银杏内酯提取工艺研究

李文东, 高乾善,杨鹏 ,杨丙田,王晓*

(1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018; 2.山东省中药质量控制技术重点实验室,山东省分析测试中心，山东 济南 250014;3. 济南森康三峰生物工程有限公司，山东 济南 250014)



【中药与天然活性产物】

银杏叶中银杏内酯提取工艺研究

李文东1,2, 高乾善2,杨鹏3,杨丙田3,王晓2*

(1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018; 2.山东省中药质量控制技术重点实验室,山东省分析测试中心，山东 济南 250014;3. 济南森康三峰生物工程有限公司，山东 济南 250014)

以银杏内酯(白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C)的提取率为指标，确定银杏叶乙醇提取的最佳提取工艺。采用正交试验设计的方法，系统考察提取时间、料液比、乙醇体积分数和提取次数4个因素对银杏叶提取工艺的影响。以异丙醇为流动相，优化高效液相色谱法(HPLC-ELSD)测定银杏内酯的含量，并计算提取率。实验得出最佳提取工艺条件为提取时间1.5 h、料液比1：20、乙醇体积分数50%、提取次数3次。本工艺可以提高银杏内酯的提取率，节约试验成本，适用于工业化生产。

银杏叶；银杏内酯；正交试验；提取率；异丙醇

银杏(GinkgobilobaL.)又名白果、公孙树、鸭脚子或鸭掌树，是银杏科银杏属中唯一的生存种属，被誉为“活化石”。我国自古以来就有银杏叶入药和食疗的记载，如《本草品汇精要》中提到，银杏叶“归肺经，能敛肺平喘，益心止痛”。20世纪70年代银杏叶提取物(extract ofGinkgobiloba, EGb)治疗中枢外周血流紊乱和脑血管动脉粥样硬化的报导出现，其药用价值受到了更为广泛的关注[1-2]。

银杏叶的化学成分复杂，已有报导的成分多达180种[3]，其中主要活性成分为萜类内酯化合物(ginkgolides and bilobalides)和黄酮类化合物(flavonoid glycosides)[4]。银杏内酯(ginkgolide)是二萜内酯，萜类内酯类化合物包括银杏内酯 A、B、C、J 和 M等，均为血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)拮抗剂[5]，可在临床上用于治疗血栓、急性胰腺炎和心血管疾病[6]。白果内酯(bilobalide)分子中含有15个碳原子，属于倍半萜类化合物，具有保护神经的作用，对老年痴呆的治疗具有良好的效果[7]。目前，从银杏叶中已分离得到8个萜类内酯化合物：银杏内酯A、B、C、J、M、K、L 和白果内酯[8-9]。银杏内酯A、B、C及白果内酯化学结构见图1。银杏内酯的分子立体结构复杂，化学合成和植物组织培养均受到技术难度大、生产成本高等因素制约，所以银杏内酯来源以提取银杏叶为主[10]。在以往的研究中都考虑到银杏黄酮的提取率，只把银杏内酯作为附带产品提取，未对银杏内酯提取率影响因素做有针对性的研究[11-13]。在检测方法方面银杏内酯目前采用高效液相色谱(HPLC)法测定，所用流动相为甲醇-四氢呋喃-水系统，其中四氢呋喃在分析过程中存在价格高、易挥发和对人有害等缺点[14-17]。本研究确定了从银杏叶中提取银杏内酯工艺的最佳参数，提高了银杏内酯的提取效率，同时优化的检测方法使银杏内酯测定更加方便快捷。

图1 银杏内酯A、B、C及白果内酯化学结构Fig.1 Chemical structures of ginkgolides and ginkgo lactone

1 仪器与试剂

KT-300Y型超声波药品处理机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Agilent 1260与385-ELSD蒸发光散射检测器(美国安捷伦科技有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；KDM型可控调温电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)。银杏叶(山东双花制药有限公司)。银杏内酯标准品(上海生化试剂厂)，其中白果内酯(纯度≥ 98%)生产批号110865-201507；银杏内酯A(纯度≥ 98%)生产批号为110862-201511；银杏内酯B(纯度≥ 98%)生产批号110863-201507；银杏内酯C(纯度≥ 98%)生产批号110864-201507。95%乙醇、石油醚和酸性氧化铝为分析纯，甲醇、异丙醇为色谱纯。

2 试验方法

2.1 银杏内酯的分析方法

所有的样品都用Agilent 1260串联385-ELSD检测器进行检测，使用YMC-Pack ODS-A( 4.6 mm×250 mm，5 μm) 的色谱柱进行分析，根据分离度最大(实际测得分离度R>7.2)、检测时间适宜的要求选用流动相为异丙醇：水(10：90，V/V)，流速为1 mL/min,气体流速为1.60 L/min (氮气)，漂移管稳定温度为 90 °C。

2.2 银杏内酯含量测定

称取银杏叶样品量20.0 g，加热回流，冷却到室温用定性滤纸(型号为102)进行过滤，分别回收不同试验条件下的银杏内酯提取液，浓缩提取液，用甲醇定容到500 mL容量瓶中，室温超声30 min，混匀，静置，取适量样品用针头式微孔过滤器滤过0.22 mm有机滤膜后进行高效液相色谱(HPLC-ELSD)检测，以10%异丙醇为流动相检测样品含量(液相色谱图见图2)，为确保此方法的准确性，进行精密度试验以及线性关系考察。

BB为白果内酯;A为银杏内酯A; B为银杏内酯B; C为银杏内酯C a 标准样品 b 提取样品图2 银杏内酯高效液相色谱图Fig.2 High performance liquid chromatography of ginkgolides

2.3 分析方法的验证

2.3.1 线性相关性

分别精密称取银杏内酯BB、C、A、B标准样品17.2、9.3、10.3、8.7 mg，用甲醇分别定容到50 mL，根据精密称定样品的量得到标准品BB、C、A、B溶液浓度分别为0.344 0、0.186 0、0.206 0、0.174 0 mg/mL，通过自动进样器控制进样体积得到BB进样量为0.002 0、0.004 0、0.006 0、0.008 0、0.010 0 mg；C、A、B进样量为0.001 0、0.002 0、0.003 0、0.004 0、0.005 0 mg；得到样品进样量与响应值峰面积的对数的线性相关性。其相关性方程及R2见表1。

表1 4种银杏内酯线性方程及R2Table 1 Linear equation of the four ginkgolides and R2

2.3.2 精密度试验

日间精密度试验:取上述配制的标准样品溶液，连续6 d每天同一时间分别取样测定4种银杏内酯，得到高效液相色谱响应值峰面积,分别计算相对标准偏差。

日内精密度试验：取上述配制的标准样品溶液，在1 d内每隔2 h取一次样，取6次分别测定样品，得到高效液相色谱响应值峰面积,分别计算相对标准偏差。结果见表2。

表2 精密度试验相对标准偏差Table 2 Accuracy experiment RSD

2.3.3 样品加样回收率的测定

精密称定银杏内酯BB、C、A、B标准样品5.8、2.6、3.0、4.5 mg，加到上述标准样品溶液中定容到50 mL容量瓶中，得到0.460 0、0.238 0、0.266 0、0.264 0 mg/mL的溶液，分别取适量样品进高相液相色谱检测并重复3次，得到的回收率平均值为99.2%、98.8%、99.7%、99.6%。以上试验证明，方法是可靠、准确的。

2.4 银杏内酯的提取率

本试验以银杏内酯提取率作为指标，选取最佳银杏叶提取工艺。准确称取样品20.0 g，经单因素试验和正交试验处理样品，过滤残渣，浓缩提取液，用甲醇定容到500 mL，进行高效液相色谱检测，通过2.2中的方法计算银杏内酯含量，计算提取率。银杏内酯包括白果内酯(BB)、银杏内酯A(A)、银杏内酯B(B)和银杏内酯C(C)的总和。具体的计算见公式(1)：

(1)

2.5 单因素试验

主要考察提取次数、提取时间(h)、乙醇的体积分数和料液比(g / mL)对银杏内酯提取率的影响，按照2.2方法测定银杏内酯，并计算提取率。

2.6 正交试验设计

本研究以银杏内酯提取率为指标，通过加热回流的方式考察影响含量的主要因素及最佳提取条件，即提取时间、料液比、乙醇体积分数和提取次数，选取如下水平进行正交试验。正交试验的因素水平见表3。

表3 正交试验因素水平表Table 3 Factor level table of orthogonal experiment design

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果与分析

3.1.1 不同提取次数对银杏内酯提取率的影响

当选择提取条件为料液比1：5，提取2 h，乙醇体积分数80%时，选取提取次数分别为 1～7 次，由图3a可知增加提取次数有利于提取率的提高，当提取次数小于3次时提取率随提取次数增加而增加，银杏内酯提取量增加；大于3 时，银杏内酯提取率趋于平稳，表明银杏叶中的内酯接近提取完全，提取次数再多提取成本变大。

图3 单因素试验中不同条件对银杏内酯提取率的影响Fig.3 Impact of different conditions in single-factor experiment on extraction rate of ginkgolide

3.1.2 不同提取时间对银杏内酯提取率的影响

当选择提取条件为料液比 1：5，提取 3 次，乙醇体积分数80%时，分别选择提取时间0.5、1、1.5、2、2.5 h，由图3b可知随着提取时间的增加，提取愈发完全，溶液中银杏内酯含量增加，所以提取率增大。但在 2 h 之后，增加提取时间，提取率基本稳定，为节约资源和时间，2 h最佳。

3.1.3 不同的乙醇体积分数对银杏内酯提取率的影响

当选择提取条件为料液比 1：5，提取时间2 h，提取次数为 3 次，乙醇体积分数选择0，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%时，由图3c可知乙醇体积分数为40%时，银杏内酯的提取率最高。当乙醇体积分数大于40%时银杏内酯的提取率下降，这可能是由于提取溶液极性变化有关。

3.1.4 不同料液比对银杏内酯提取效果的影响

当选择提取条件为提取 3 次，提取时间2 h时，在乙醇体积分数为80%的条件下，选取料液比为 1：5、1：10、1：15、1：20、1：25，由图3d可知料液比(g/mL)大于 1：15时，乙醇溶液对银杏内酯提取效果不好，提取率较低。随着料液比的减小，即溶剂量的增加，有利于银杏内酯的充分溶解，所以提取率增加。在料液比小于 1：15时，提取率趋于稳定。

3.2 正交试验结果

按L9(34)正交设计研究乙醇溶液加热回流提取银杏内酯，以4种银杏内酯总量为指标，正交试验结果见表4。

表4 银杏内酯提取工艺正交试验结果Table 4 Orthogonal experiment results of extraction technology of ginkgolides

通过表5方差分析可知，乙醇浓度和提取次数对银杏内酯含量有显著影响，且影响程度乙醇体积分数大于提取次数，其影响顺序为C>D>A>B，得出最佳提取工艺为A1B2C3D3，即提取时间1.5 h，料液比1：20，乙醇体积分数50%，提取次数3次时，银杏内酯提取率最高。

表5 银杏内酯正交提取试验方差分析表Table 5 Variance analysis of orthogonal extraction experiment of ginkgolides

3.3 验证结果

为进一步验证优化工艺的可靠性及稳定性，取3份药材各20 g,按上述最佳提取工艺即提取时间1.5 h，料液比1：20，乙醇浓度50%，提取次数3次进行验证试验，操作方法同前。结果表明，银杏内酯平均提取率为0.6786%，RSD为0.83%，表明此工艺稳定可行。

4 结论

本试验以银杏叶为原料，通过正交试验的方法确定最佳的提取工艺为提取时间1.5 h、料液比1：20、乙醇体积分数50%、提取次数3次。此方法可以用于指导实际生产，提高银杏内酯的提取率，减少生产成本。通过优化银杏内酯的检测方法，用异丙醇做流动相，可以减少杂质对被测物质的干扰，并提高被测物质的分离度(R>7.2)，改善峰形，更加快速高效地测定提取物中银杏内酯的含量。试验结果表明，本方法准确、可靠。

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Extraction technology of ginkgolides fromGinkgobilobaleaves

LI Wen-dong1,2, GAO Qian-shan2,YANG Peng3, YANG Bing-tian3,WANG Xiao2*

(1.School of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China; 2. Shandong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China; 3. Jinan Senkang Sanfeng Biological Engineering Co. LTD, Jinan 250014, China)

∶We determined optimum extraction condition ofGinkgobilobaleaves with the extraction rate of ginkgolides (ginkgo lactone, ginkgolides A, ginkgolide B and ginkgolide C) as an index. We employed orthogonal experiment to systematically investigate the impact of extraction time, solid-liquid ratio, ethanol concentration, and extraction time on extraction technology ofGinkgobilobaleaves. Ginkgolides content was determined through optimization of high performance liquid chromatography (HPLC-ELSD) and isopropanol of mobile phase. We also calculated extraction rate. Optimum extraction conditions are extraction time of 1.5 h, solid-liquid ratio of 1：20, ethanol concentration of 50% and extraction times of 3. This technology can improve extraction rate of ginkgolides, save testing cost, and is applicable to industrial production.

∶Ginkgobilobaleaves; ginkgolides; orthogonal experiment; extraction rate; isopropyl alcohol

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.005

2016-02-22

山东省科技发展计划(2014GZX219003)

李文东(1990—)，男，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏工程。

*通信作者，王晓，男，研究员，研究方向为天然产物研究与开发。Email：wangx@sdas.org

R284.2; O656.3

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