九味补血口服液质量标准研究

黄若干 裴泽建 黄平权 蓝晓东 覃佩莉 梁杰敏 林海英 王小红

广西盈康药业有限责任公司，广西 南宁 530023



九味补血口服液质量标准研究

黄若干 裴泽建 黄平权 蓝晓东 覃佩莉 梁杰敏 林海英 王小红

广西盈康药业有限责任公司，广西 南宁 530023

目的：提高九味补血口服液质量标准。方法：采用薄层色谱法对人参、绞股蓝、黄芪进行定性鉴别，采用HPLC法对五味子中五味子醇甲进行定量分析。结果：人参与绞股蓝、黄芪的薄层色谱均具有特征性的清晰斑点，阴性溶液无干扰；五味子醇甲在0.05100～1.5300μg范围内其峰面积与进样量呈良好的线性关系，平均加样回收率为100.97%(RSD=0.91%)。结论：研究建立的定性鉴别与定量分析方法灵敏、准确，具有良好专属性和重现性，更能有效控制九味补血口服液的质量。

九味补血口服液；人参；绞股蓝；黄芪；五味子醇甲

九味补血口服液由人参、黄芪、绞股蓝、当归等药味组成，具有益气补血、健脾益胃的功效。原标准只建立当归、甘草、陈皮的薄层色谱鉴别和正丁醇提取物测定方法，方中君药人参、黄芪等均未建立有定性或定量的质控指标，为能更加有效控制本品质量，实验开展人参、黄芪、绞股蓝薄层色谱鉴别研究和五味子中五味子醇甲HPLC测定研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-10ATVP高效液相色谱仪(日本岛津)。

1.2 材料 人参皂苷Rb1(批号：110704-200318)、人参皂苷Rg1(批号：110713-200322)、黄芪甲苷(批号：0781-200109)、五味子醇甲(批号：110857-201513)对照品、人参(批号：120917-200406)、绞股蓝(批号：121311-200402)对照药材均购自中国药品生物制品检定研究院；九味补血口服液(批号：131201、131202、131203，广西盈康药业有限责任公司)。乙腈、磷酸为色谱醇；水为纯化水；其余试剂均为分析纯。2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别2.1.1 人参和绞股蓝的薄层鉴别 取本品30mL，加三氯甲烷30mL，振摇提取，分取上层溶液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次(30mL，30mL，20mL)，合并正丁醇提取液，用氨试液提取2次，每次50mL，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次50mL，分取正丁醇液，蒸干，残渣加10%乙醇5mL使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，用水50mL洗脱，弃去水洗脱液，再用40%乙醇30mL洗脱，弃去40%乙醇洗脱液，继用70%乙醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取人参对照药材0.8g和绞股蓝对照药材2g，同法制备成对照药材溶液；再取人参皂苷Rb1、Rg1对照品加甲醇制成每1mL各含1mg的对照品溶液。按处方比例制备缺人参、绞股蓝的阴性样品，同法制成阴性溶液。照薄层色谱法(中国药典2015版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各1～2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂[1]8，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。置日光下检视，供试品色谱中，分别与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置紫外光(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图1。

2.1.2 黄芪的薄层鉴别 取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。取2.1.1项的供试品溶液作为供试品溶液。按本品制法制备缺黄芪阴性样品，同法制备阴性溶液。照薄层色谱法(中国药典2015版四部通则0502)试验，吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以(正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)上层溶液)-甲醇(10∶1)[1]302为展开剂，置氨气饱和的层析缸内，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性试验无干扰。见图2。

2.2 五味子醇甲的含量测定[1]66

2.2.1 色谱条件及系统适用性 照中国药典2015版四部通则0512高效液相色谱法，色谱柱为日本岛津公司BDS C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；以甲醇-水(60∶40)为流动相；检测波长为250nm；理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于1500。

2.2.2 溶液的配制 ①对照品溶液制备：精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1mL含50μg的对照品溶液。②供试品溶液制备：精密量取本品10mL，置分液漏斗中，加水20mL，混匀，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次30mL，合并乙酸乙酯液，置水浴上蒸干，残渣分次加甲醇适量使溶解并转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。③阴性样品溶液制备：按标准处方工艺制备不含五味子的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备成阴性样品溶液。

分别精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，专属性试验色谱图见图3、4、5。试验结果表明，供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置有相应的色谱峰出现，且该色谱峰和其他组分色谱峰分离度符合规定，阴性样无干扰，说明该方法的系统适用性和专属性良好。

2.2.3 线性关系试验 精密称取五味子醇甲对照品12.75mg，置50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(含五味子醇甲0.2550mg/mL)，精密量取该贮备液0.5mL、2.5mL、5.0mL、7.5mL、10mL、12.5mL、15mL分别置25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取上述对照液各10μL注入液相色谱仪，结果峰面积分别为97065、497390、993624、1500990、2016087、2520814、3022343。以五味子醇甲峰面积(A)为横坐标，对照品进样量(μg)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：Y=5.0460×10-7X-0.0047(r=0.9999，n=7)。结果五味子醇甲在0.05100～1.5300μg范围之间线性关系良好。

2.2.4 精密度试验 精密吸取同一批样品的供试品溶液10μL注入液相色谱仪，重复进样6次，记录五味子醇甲色谱图及峰面积，分别为1075998、1067577、1065693、1067843、1079951、1082658，平均峰面积1073287，RSD为0.67%(n=6)，表明精密度良好，符合要求。

2.2.5 重复性试验 取本品同一批号的样品，照含量测定项下供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算含量分别为54.06、53.79、54.13、53.84、53.76、54.25μg/mL，平均53.97μg/mL，RSD为0.38%(n=6)，说明重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 照上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，取该供试品溶液分别于0h、4h、8h、16h、24h测定峰面积，分别为1076001、1069854、1072581、1070732、1078765、1069781，平均1072952，RSD为0.34%。表明供试品溶液24h内稳定性良好。

2.2.6 加样回收试验 取已知五味子醇甲含量的本品同一样品(批号：131201，含量为53.97μg/mL)，精密量取5mL，加水25mL，共9份，分别精密加入对照品贮备液(浓度为0.1376mg/mL)1mL、2mL、3mL，低、中、高浓度各3份，照供试品溶液制备项下的方法处理、测定。结果表明，本法加样回收率相对标准偏差符合标准规定。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.2.7 样品的含量测定 按上述含量测定方法测定了本品10批样品五味子醇甲的含量，结果分别为54.0、61.7、45.6、73.1、54.2、42.8、41.9、56.3、64.7、69.2μg/mL。

3 讨论

3.1 人参中含有多种人参皂苷，绞股蓝中主要含四环三萜皂苷，其中多种皂苷结构与人参皂苷相同，如人参皂苷Rb1、Rd、Rb3和F2等[2]，为方便实验操作，故在预试验时就设计采用同一方法同时对这两味药材进行薄层鉴别。在进行人参、绞股蓝薄层鉴别预试验摸索过程中，曾尝试使用过(正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)上层溶液)-甲醇(10∶1)、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)等展开剂，但因制剂中含皂苷成分太多，分离效果均不够理想，最终以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂最为理想，在此条件下，斑点能较好的分离且清晰圆整，Rf值适宜，方法简便，重现性好。

3.2 《中国药典》中黄芪使用黄芪甲苷作为对照品进行薄层鉴别，我们也拟定采用黄芪甲苷作为本药材的鉴定指标。在进行黄芪薄层鉴别预试验时，曾尝试使用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层液等展开剂，分离效果均不够理想，最终以(正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)上层溶液)-甲醇(10∶1)为展开剂最为理想，此法重现性好，专属性强。

3.3 在进行本试验的含量测定方法摸索时，曾尝试使用HPLC法对方中的人参、绞股蓝建立含量测定方法，以人参皂苷Rb1、Rg1对照品为含测指标，但阴性样有干扰而无法建立。五味子醇甲含测方法流动相经选择甲醇-水不同比例进行比较，最终甲醇-水的比例为60∶40时主成分峰分离度、峰形最佳；五味子醇甲甲醇溶液在250nm处有最大吸收而选择此波长作为检测波长；对于供试品溶液的制备，曾选用乙醚、乙酸乙酯对样品进行萃取处理，结果乙醚萃取乳化严重，而乙酸乙酯萃取效果良好而被选用。

本试验对方中的人参、绞股蓝、黄芪等药味进行定性鉴别和对五味子醇甲进行定量测定，方法灵敏、准确，具有较好专属性和重现性，为九味补血口服液提升质量控制方法提供具有参考价值的科学依据。从测定的10批样品中五味子醇甲的含量来看，五味子醇甲的最低含量为41.9μg/mL，最高为73.1μg/mL。造成样品中五味子醇甲含量高低不均的原因，应该是五味子药材不同批次之间因产地、采收季节、贮藏等因素的影响而使五味子醇甲含量存在差异性，因此在投料生产时要把好药材质量关，以保证制剂质量的稳定性。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015:8,302,66.

[2]国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草[M].上海：上海科技出版社，1999：533.

(编辑：程鹏飞)

Study on Quality Standard of Jiuwei Buxue Oral Liquid

HUANG Ruogan PEI Zejian HUANG Pingquan LAN Xiaodong QING Peili LIANG Jiemin LIN Haiying WANG Xiaohong

Guangxi Yingkang Pharrmacy Co. Ltd.，Nanning 530023，China

Objective To improve the quality standard of Jiuwei Buxue oral liquid. Methods Thin layer chromatography was used to identify Ginseng Radix Et Rhizoma, Gynostemma and Astragali Radix. High performance liquid chromatogranhy was used to determine schisandrin content in Schisandra Chinensis. Results The chromatographic spots of Radix Et Rhizoma, Gynostemma and Astragali Radix were claer with characteristic, and negative solution didn’t interfere with this result. The peak area and sample volume of schisandrin showed a good linearity at a range at 0.05100 to 1.5300μg and the average recovery was 100.97% (RSD=0.91%).Conclusion This study established the metohd of qualitative identification and quantitative anlysis is Sensitive and accurate and has good specificity and reproducibility, which can be used to control the quality of Jiuwei Buxue oral liquid better.

Jiuwei Buxue Oral Liquid;Radix Et Rhizoma; Gynostemma; Astragali Radix；Schisandrin

2016-09-19

广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻14124004-2-5)；南宁市科学技术与技术开发计划项目(20133328)。

黄若干(1973-)，男，主管药师，主要从事中药制剂的生产、新药开发研究以及中药质量标准研究。E-mail:huangruogan@163.com

R284

A

1007-8517(2016)23-0016-04