注射丹参多酚酸盐对ApoE基因敲除小鼠血清TNF－α和IL－6的影响

高玉琪，胡毓洪，梁 春，吴宗贵

基础医学

注射丹参多酚酸盐对ApoE基因敲除小鼠血清TNF－α和IL－6的影响

高玉琪，胡毓洪＊，梁 春，吴宗贵

目的 观察C57BL/6J ApoE基因敲除小鼠在丹参多酚酸盐（salvianolate，SAL）干预下血清肿瘤坏死因子－α（Tumor necrosis factor－α，TNF－α）和白细胞介素－6（Interleukin－6，IL－6）的变化，探讨SAL抗动脉粥样硬化的可能机制。方法 给4周龄雄性C57BL/6J ApoE－/－小鼠（共40只）和C57BL/6J野生型小鼠（10只）分别行高脂饮食处理，采用腹腔注射给药（1次/d，5次/w）方法，随机将其分为4组，模型组10只，腹腔注射生理盐水；丹参多酚酸盐低剂量（60 mg/kg）组10只、中剂量（120 mg/kg）组10只、高剂量（240m g/kg）组10只和C57BL/6J野生型小鼠，即正常对照组10只。24 w末时处死各组小鼠，留取血清，采用特异性放射免疫法测定各组小鼠血清TNF－α和IL－6浓度。结果 24 w末时，模型组小鼠TNF－α和IL－6血清浓度明显升高；丹参多酚酸盐干预各组TNF－α和IL－6血清浓度均明显低于模型组（P均＜0.05）；随SAL浓度增加，各干预组TNF－α和IL－6血清浓度逐渐降低（P均＜0.05），但仍均高于正常对照组水平（P均＜0.05）。结论 SAL干预后ApoE－/－小鼠TNF－α和IL－6水平下降，说明其可能通过降低动脉粥样硬化炎症反应进程来发挥抗动脉硬化作用。

丹参多酚酸盐；肿瘤坏死因子－α（TNF－α）；白细胞介素－6（IL－6）；ApoE－/－小鼠；放射免疫试验

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）发病机制非常复杂。随着炎症细胞和炎症介质的不断检出，AS不再被认为是单纯的动脉壁脂质堆积，而是进展性炎症反应性疾病，因此，Ross在其损伤反应学说的基础上，明确提出“AS是一种炎症性疾病”［1］。肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）和白细胞介素－6（interleukin－6，IL－6）是已经证实参与AS炎症发病机制的重要促炎因子，能够促进AS的发展；丹参是祖国传统活血化瘀中药，临床应用广泛，丹参多酚酸盐（salvianolate，SAL）是从丹参中提取的水溶性有效成分，已有研究证实其具有抗氧化、抗氧自由基、降低细胞内游离钙浓度、抗血小板聚集、改善微循环、抗血栓形成、促进内皮修复等多种作用［2］能抑制平滑肌细胞增殖和稳定动脉粥样硬化斑块［3］。SAL能否抑制ApoE－/－小鼠血清促炎因子TNF－α和IL－6水平则尚未见报道。笔者通过观察SAL干预后C57BL/6J ApoE－/－小鼠血清TNF－α和IL－6水平的变化，探讨其抗AS可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组和给药 4周龄雄性C57BL/6J AopE－/－小鼠42只，普通饲料喂养2 w后给予高脂饮食（普通饲料+2%胆固醇+5%的猪油）喂养12 w后，随机处死2只，取主动脉根部，HE染色普通光镜下观察，确定已形成动脉粥样硬化斑块后，将其余40只C57BL/6J AopE－/－小鼠随机分成4组，即模型组（仅腹腔注射生理盐水，10只）、丹参多酚酸盐60 mg/ kg组（10只）、丹参多酚酸盐120 mg/kg组（10只）、丹参多酚酸盐240 mg/kg组 （10只），正常对照组（即C57BL/6J野生型小鼠）10只。注射用丹参多酚酸盐100 mg溶于0.9%的氯化钠注射液10 ml中，按以上不同剂量给予腹腔注射，1次/d，5次/w，继续高脂饲料喂养至24周末。

1.2 药品来源 注射用丹参多酚酸盐由上海绿谷制药有限公司生产，批号：070602，规格100 mg/支。

1.3 血液标本的采集 于实验24 w末各组小鼠腹腔注射苯巴比妥钠麻醉后（麻醉前禁食12 h）后摘取眼球，取血1.5 ml（处死动物前），立即以800 g/ min的速度离心10 min，留取血清于－70℃低温冰箱中保存待测。

1.4 检测方法 采用特异性放射免疫法测定各组血清TNF－α和IL－6水平，按试剂盒说明书操作。TNF－α和IL－6 RIA kit购自解放军总医院科技开发中心免疫技术研究所。TNF－α RIA kit剂盒灵敏度：0.3 ng/ml；批内变异系数CV＜5%，批间CV＜8%；本抗血清与EPO、TGF、IL－2、IL－6、IL－10、IL－12均无交叉反应。IL－6 RIA kit试剂盒灵敏度：0.3 pg/ ml；批内变异系数CV＜5%，批间CV＜8%；本抗血清与EPO、TGF、IL－2、TNF－α、IL－8均无交叉反应。采用上海日环光电仪器有限公司SN－697型双探头γ计数仪测定各组小鼠血清TNF－α和IL－6浓度。

1.5 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件包进行统计学处理。实验数据以（±s）表示，两组间比较用t检验，多组间比较采用完全随机设计的方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

C57BL/6J野生型小鼠饲养过程中死亡1只；模型组和SAL（60 mg/kg）组各死亡1只、SAL（120 mg/ kg）组和SAL（240 mg/kg）组各死亡2只。24周末，随SAL剂量的增加，ApoE－/－小鼠血清浓度逐渐降低，SAL各剂量组血清TNF－α和IL－6浓度均低于模型组（P＜0.05）；SAL（60 mg/kg）组血清TNF－α和IL－6水平分别与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；SAL（120 mg/kg）组血清TNF－α和IL－6水平明显低于60 mg/kg组（P＜0.05），240 mg/kg组血清TNF－α和IL－6水平分别明显低于 （120 mg/kg）组和（60 mg/kg）组（P均＜0.05），SAL（240 mg/kg）组IL－6水平仍分别明显高于正常对照组水平 （P均＜0.05）。见表1。

表1 SAL对ApoE-/-小鼠血清TNF-α和IL-6浓度的干预作用（±s）

表1 SAL对ApoE-/-小鼠血清TNF-α和IL-6浓度的干预作用（±s）

与正常对照组比较＊P＜0.05，与模型组比较ΔP＜0.05，与SAL（60 mg/kg）组比较，#P＜0.05；与SAL（120 mg/kg）组比较，▲P＜0.05。

组别 n T N F－α（n g / m l） I L－6（p g / m l）正常对照组 9 1.0 9 ± 0.0 9 4 0.3 6 ± 1 1.5 3模型组 9 1.4 5 ± 0.1 2＊ 3 7 8.4 5 ± 6 6.8 1＊S A L（6 0 m g / k g）组 9 1.2 1 ± 0.0 6＊Δ 2 5 8.3 2 ± 5 3.1 9＊ΔS A L（1 2 0 m g / k g）组 8 0.8 2 ± 0.0 7＊Δ# 1 6 5.7 7 ± 3 0.0 3＊Δ#S A L（2 4 0 m g / k g）组 8 0.6 5 ± 0.0 8＊Δ#▲ 1 0 9.6 1 ± 2 7.1 8＊Δ#▲

3 讨论

慢性炎症反应贯穿炎症性AS的整个过程，大量促炎细胞因子参与其中，形成复杂的网络调节，并最终形成炎症瀑布效应，加重血管内膜损伤，导致AS进展。在免疫炎症反应过程中，血液中的单核－巨噬细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞能够分泌多种促炎性细胞因子，如TNF－α和IL－6等，进一步促进AS局部炎症反应；TNF－α和IL－6均可通过细胞内信号转导机制刺激其他相关炎症介质和细胞因子的基因转录增强，促进炎症介质和细胞因子进一步释放，使得信号转导级联反应炎症信号不断放大，促进更多的单核细胞聚集、浸润，最终促使AS病变进展恶化［4］。

TNF－α是由巨噬细胞分泌的一种致炎性细胞因子，具有致炎性、引发细胞坏死和新生血管形成，促进内皮素的产生并引起血管内皮损伤，诱使血小板聚集和血栓形成，表现促AS形成作用。IL-6亦主要是由巨噬细胞分泌的一种重要的致炎性细胞因子，可引起血管炎症反应，增加AS斑块面积，是冠状动脉性疾病的独立危险因素。

由于AS是动脉管壁增厚变硬，失去弹性和管腔缩小的血管病，虽然对其发病机制进行了大量和长期研究，但仍未找到确切的发病机制。目前主要有4种学说：脂肪浸润学说、血小板聚集和血栓形成学说、平滑肌细胞克隆学说和损伤反应学说等。由于AS发病机制复杂、病因多种多样，决定了其药物治疗无特异性，必须从多方面、多角度、多层面来进行干预。目前有许多药物对其干预治疗，如扩血管、调脂、抗血小板聚集、溶栓和抗凝药物等，但AS的发病率和AS引起的各种并发症导致的病死率仍居高不下。因此，寻找有效药物进行AS早期干预，是防治AS的主要和迫切目标。

SAL是采用现代科学技术从传统中药丹参中提取的水溶性有效成分，具有抗氧化、抗氧自由基和抗栓、抗血小板聚集、扩张冠状动脉、改善心肌血流量［5-8］和降低全血高切黏度、全血低切黏度、红细胞聚集指数、纤维蛋白原、增加红细胞变形指数以改善微循环；抑制心肌损伤，保护缺血再灌注细胞等多重功效［9，10］。

笔者发现随SAL腹腔注射剂量的增加，ApoE基因缺陷小鼠血清TNF-α和IL-6浓度逐渐降低，说明SAL具有降低AS易感小鼠血清重要的致炎细胞因子水平，且随剂量的增加，降低更加明显。因此，SAL可能通过减少AS斑块炎症反应过程，减少血管内皮损伤程度以延缓AS形成过程。

因此，SAL降低AS形成过程中重要致炎性细胞因子水平，以延缓AS发生和发展过程，可能是其抗AS多效性保护作用机制之一，可能为SAL抗AS有效作用靶点提供重要理论依据，并可能为防治AS性心脑血管疾病提供一条有效途径。

有关丹参多酚酸盐对TNF-α和IL-6的作用是直接还是间接的，其具体信号转导途径如何，还需要大量细致研究证实。但传统活血化瘀中药独特的多效性药理作用和作用机制多样性等的特点，可能成为中药开辟抗AS的新途径和新方法。

［1］Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease［J］.N Engl J Med，1999，340（2）：115-126.

［2］杜冠华，张均田.丹参水溶性有效成分：丹酚酸研究进展［J］.基础医学与临床，2000，20（5）：394-398.

［3］窦维华，陈尚杰，董少龙，等.活血化瘀中药抗动脉粥样硬化的研究进展［J］.江苏中医药，2004，25（1）：59-60.

［4］张 伟，李 锋，王玉琴，等.二苯乙烯苷对实验性动脉粥样硬化大鼠血脂和炎症因子的调节作用［J］.中国临床药理学和治疗学，2007，12（5）：516-520.

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［9］何雪松，陈建昌，朱凌波.丹参多酚酸盐对稳定型心绞痛患者血液流变学影响的临床研究［J］.中国血液流变学杂志，2008，18（1）：92-93.

［10］刘志宁，赵庆霞，尤 莉.丹参多酚酸盐注射液对猝死型冠心病复苏过程中的心肌保护作用［J］.南方医科大学学报，2010，30（3）：645-646.

［2016－06－18收稿，2016－07－15修回］ ［本文编辑：韩仲琪］

The effect of salvianolate on the serum levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in knockout ApoE-/-gene mice

GAO Yu－qi①，HU Yu－hong，LIANG Chun，et al.①Department of Cardiology，the General Hospital of Jinan Military Region，Jinan，Shandong 250031，China

ObjectiveTo explore the possible antiatherosclerotic mechanism ofsalvianolate，through investigating its effect on the serum levels of tumor necrosis factor－α（TNF－α）and interleukin－6（IL－6）in C57BL/ 6J knockout ApoE－/－gene mice.MethodsForty C57BL/6J ApoE－/－male mice of 4 week－old，and C57BL/6J wild mice （as control group，n=10） were fed by high cholesterol diet，at the same time salvianolate was given intraperitoneally，except for control group being normal with injecting drug.They were injected 5 times per week，1 time/d，randomly divided into 4 groups（10，each group）：model group，low dosage of salvianolate（60 mg/kg）group，medium dosage of salvianolate（120 mg/kg）group，high dosage of salvianolate（240 mg/kg）group.At the end of 24 weeks，serum levels of TNF－α and IL－6 were measured by specific radioimmunoassay.ResultsAt the end of 24 weeks the levels of TNF－α and IL－6 in all the model groups were all significantly increased.The serum levels of TNF－α and IL－6 were decreased in ApoE－/－mice with the increase of salvianolate concentration in low，medium and high groups（P＜0.05）.The serum levels of TNF－α and IL－6 in every salvianolate groups were lower than those in model group（P＜0.05）and still higher than control group（P＜0.05）.ConclusionSalvianolate can decrease the serum levels of TNF－α and IL－6 in C57BL/6 ApoE－/－mice and inhibit inflammation process，which could be possible mechanism of antiatherosclerotic of salvianolate.

Salvianolate；Tumor necrosis factor－α；Interleukin－6；ApoE－/－mice；Radioimmunoassay

R541.4：R－332

A

10.14172/j.issn1671－4008.2016.12.020

250031山东济南，济南军区总医院心内科（高玉琪，胡毓洪）；200003上海，第二军医大学长征医院心内科（梁春，吴宗贵）

胡毓洪，Email：dr_huyuhong＠163.com