hnRNP A2/B1在乳腺癌组织中表达水平及其凋亡调控的研究

刘蜀 王兰 吴培新

(贵阳市妇幼保健院，贵州 贵阳 550003)

hnRNP A2/B1在乳腺癌组织中表达水平及其凋亡调控的研究

刘蜀 王兰 吴培新

(贵阳市妇幼保健院，贵州 贵阳 550003)

目的 检测乳腺癌组织标本中hnRNP A2/B1的表达水平；探讨hnRNP A2/B1基因对乳腺癌细胞株 MCF-7 凋亡的影响。方法 选取乳腺癌患者40例、乳腺纤维瘤患者20例(对照)，采用免疫组化方法检测组织中hnRNP A2/B1的表达水平；体外培养乳腺癌细胞株MCF-7，并将hnRNP A2/B1 siRNA转染至MCF-7中，TUNEL法检测转染前后MCF-7细胞的凋亡情况。结果 40例乳腺癌组织标本中36例有hnRNP A2/B1阳性表达，而作为对照的乳腺纤维瘤组织中只有3例有hnRNP A2/B1阳性表达，乳腺纤维瘤组与乳腺癌组hnRNP A2/B1表达水平差异有统计学意义(P<0.01)。体外培养乳腺癌细胞MCF-7在转染hnRNP A2/B1 siRNA后，MCF-7细胞凋亡明显增加。结论 hnRNP A2/B1 在乳腺癌组织中的表达较乳腺纤维瘤组织高，推测hnRNP A2/B1与乳腺癌的发生有关。通过siRNA干预、降低hnRNP A2/B1的表达水平可以促进乳腺癌细胞凋亡，提示hnRNP A2/B1可能通过抗肿瘤细胞失巢凋亡实现肿瘤的发生。

乳腺癌细胞; hnRNP A2/B1; 细胞凋亡

乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌，多数于40～45岁死亡[1]。新的观点认为，细胞癌变是由于信号通路途径发生了改变，即细胞接受了异常的生长、增殖、分化信号所致[2]。信号分子的异常激活在肿瘤发生、转移中起非常重要的作用，其中以核内不均一性核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNPs)及相关信号分子的激活尤为瞩目[3]。作为hnRNPs家族成员之一的核内不均一核糖核蛋白 A2/B1是脊椎动物前体 mRNA结合蛋白, 是hnRNP 家族的核心成员。一般认为它可能参与了mRNA的转运和转录后调节；此外由于 hnRNPA2 /B1 能结合单链 DNA, 故可能在 DNA 复制、转录及重组中也起作用[4]。目前越来越多的证据[5]支持 hnRNP A2/B1 与细胞生长调节和癌变存在密切关系。有研究[6-7]发现hnRNP A2 /B1在肺癌组织中表达增高，在口腔与食管癌的鳞癌中以及某些自身免疫病如系统性红斑狼疮组织中其表达也出现了上调的现象，但发生机制尚不清楚。本实验通过检测hnRNP A2/B1 在乳腺癌组织中的表达情况，并通过siRNA干预、降低hnRNP A2/B1的表达水平，了解其对乳腺癌细胞凋亡的影响，从而推测其是否与乳腺癌的发生相关。

1 材料与方法

1.1 实验分组

实验组：女性40例，选自贵阳市妇幼保健院2005年1月至2009年1月间乳腺癌患者；对照组：女性20例，选自贵阳市妇幼保健院同期乳腺纤维瘤患者。全部病例诊断在术中或术后均经病理学证实，所有乳腺癌病例术前均未接受任何放化疗。肿瘤组织取出后10 min内福尔马林固定，后制成石蜡切片。

1.2 材料

鼠抗人hnRNP A2/B1单克隆抗体(美国Sigma公司)；SP-9002小鼠免疫组化试剂盒(北京中杉金桥公司)；MCF-7乳腺癌细胞株(中科院上海生命科学研究院细胞资源中心)；hnRNP A2/B1的siRNA(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；0.01M PBS(北京市中杉金桥公司)；浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥)；DMEM培养基、特级胎牛血清(美国Gibico公司)；Protein A/G PLUS Agarose(美国Santa Cruz公司)；complete，Mini，EDTA-Free蛋白酶抑制剂(美国Roche公司)；MTT比色法细胞繁殖定量试剂盒(美国Genmed公司)；Matrigel(美国BD Biosciences公司)；Fibronectin(美国BD Biosciences公司)；TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 实验方法

本实验在贵阳市妇幼保健院病理科及第三军医大学西南医院乳腺中心实验室完成。

1.3.1 免疫组化检测乳腺癌细胞中hnRNPA2/B1的表达 操作流程严格按免疫组化试剂盒说明书进行。结果判断：每例组织切片随机观察5个高倍(HPFs×400)视野，并计数500个乳腺癌细胞。阳性细胞比例<5%为(-)； 5%～25%为(+)；25%～50%为(++)；>50%为(+++)[8]。

1.3.2 检测hnRNP A2/B1对乳腺癌细胞凋亡的影响 (1)设计hnRNP A2/B1的siRNA：应用 Premier5.0软件设计引物，并交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物 ：5’GGACGCCUUCUCUUAGAGA dTdT 3’；下游引物：3’dTdTCCUGCGGAAGAGAAUCUCU 5’。(2)细胞培养：1)细胞复苏及培养：将冻存的MCF-7细胞加入5mL DMEM培养基，根据情况对细胞进行换液，待细胞生长至80%以上时可进行细胞传代。2)细胞传代：观察细胞形态，待细胞形态由梭型转变为圆形后，弃去胰酶并立即加入DMEM培养基终止反应，充分吹打使细胞分散后加入细胞培养瓶中。(3)细胞转染：按照Promega公司codebreaker siRNA转染试剂转染方法进行。(4)Western-Blot检测蛋白表达水平变化：蛋白样品制备好后进行蛋白定量(BCA法)，定量方法按照美国PREICE公司提供的BCA Protein Assay Kit说明书操作。然后进行蛋白质SDS-PAGE电泳、转膜、化学发光、显影及定影。(5)TUNEL法检测细胞凋亡： 严格按照试剂盒说明书进行。评估方法：在光镜下以高倍镜 (×400)随机选取10 个视野，计算凋亡细胞数及未凋亡细胞数。结果取平均数计算凋亡指数(AI)：凋亡细胞百分率=凋亡细胞总数/细胞总数×100%。

1.4 统计学处理

所有数据用SPSS18.0软件进行统计分析，多组均数间比较采用相关分析法，两总体均值比较采用独立样本秩和检验，P<0.01示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组化检测hnRNP A2/B1在乳腺癌细胞中的表达

hnRNP A2/B1在乳腺癌细胞中的表达主要位于胞核内，棕黄色颗粒为阳性表达。40例乳腺癌组织标本中36例呈阳性表达，而作为对照的乳腺纤维瘤组织中只有3例有hnRNP A2/B1阳性表达(表1、图1)。对乳腺癌组与乳腺纤维瘤对照组做两独立样本秩和检验，结果显示乳腺纤维瘤组与乳腺癌组hnRNP A2/B1表达水平差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 两组组织标本中hnRNP A2/B1阳性表达

图1 两组组织标本中hnRNP A2/B1的表达

2.2 hnRNP A2/B1siRNA对乳腺癌细胞凋亡的影响

MCF-7细胞转染hnRNP A2/B1 siRNA后 ,用荧光二抗进行孵育，于荧光显微镜下观察hnRNP A2/B1的表达 , 48 h左右转染表达最强。见图2。

图2 转染48h后hnRNP A2/B1的表达

Western-Blot检测乳腺癌细胞转染hnRNP A2/B1 siRNA后的表达情况见图3。

注：1未转染 2转染空白质粒 3转染后

TUNEL法检测细胞凋亡结果：与未转染组相比，转染hnRNP A2/B1siRNA后，MCF-7细胞凋亡发生率明显升高(图4)，而转染GFP的MCF-7细胞与未转染细胞间无明显差异。以上结果提示，抑制hnRNP A2/B1活性后可以促进MCF-7乳腺癌细胞凋亡。

图4 TUNEL法检测乳腺癌细胞凋亡

3 讨 论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一 ，但其病因及发病机制尚不清楚，影响乳腺癌发病的因素也很多。

hnRNPs及相关信号分子的异常激活在肿瘤发生、转移中起非常重要的作用。hnRNP是一种核内的 RNA 结合蛋白[9], 是由 30多个蛋白质小分子构成的复合体 ,包括 A1-U 等 30多个小分子, 特别是 A、B组为基本核心成分。hnRNP A2 与hnRNP B1结构相似, 高度同源。一般认为两者是由同一基因( hnRNP A2/B1)起源, 经过剪接、插入而形成的变异体。因此, 常将两者合称为hnRNPA2/ B1。hnRNP A2/B1是一种重要的 RNA 连接蛋白, 是细胞核中异质性细胞核糖蛋白核心复合体的主要成分[10]，参与许多重要的细胞生理作用, 包括RNA 的拼接, Pre-mRNA 的成熟和降解, 端粒、端粒酶DNA 序列的调节,mRNA 由胞核到胞质的转运和转录后调节, 细胞有丝分裂、成熟、分化及凋亡的调节等[11-21]。它在癌细胞和增殖的细胞中过度表达，可能是细胞癌变的原因之一[22]。目前越来越多的证据支持 hnRNP A2/B1 与生长调节和癌变密切相关[23]。此外许多肿瘤都存在微卫星改变(microsatellite alter-ation， MA )和杂合性丢失 (LOH )。有学者[24]发现不仅MA 与 hnRNP A2/B1 表达过度存在统计学意义上的相关性，而且那些有两个以上 MA 发生位点者更有可能存在 hnRNP A2/B1 的表达过度，提示它有可能是一种癌生长蛋白。同时越来越多的资料表明 hnRNP A2/B1 在良性与恶性组织中的表达存在明显差异，显示为正常或良性组织的不表达或低表达以及恶性组织的高表达，甚至于从正常到恶性组织的表达呈递增现象。

在本实验中我们发现，40例实验组乳腺癌组织标本中36例呈hnRNP A2/B1阳性表达，而作为对照组的乳腺纤维瘤组织中只有3例阳性表达，两组在hnRNP A2/B1表达水平上差异显著(P<0.01)。这一结果与Pino等[25]的报道基本一致。

hnRNP A2/B1作为一种重要的 RNA 连接蛋白，参与细胞有丝分裂、成熟、分化及凋亡的调节等重要的细胞生理作用。细胞凋亡是生物体内广泛存在的一种重要生命过程，凋亡对组织器官的生理调节、病理发生和细胞死亡的自身调节作用已被证实，在脱离原来生存环境的特殊情况下发生的细胞凋亡称为失巢凋亡。失巢凋亡的意义在于防止这些脱落的细胞种植并生长于其它不适宜的地方。而肿瘤细胞，尤其是一些容易发生远处转移的恶性肿瘤细胞，具有极强的抗失巢凋亡特性，从瘤体上脱落进入循环系统后并不发生凋亡，从而完成转移过程。而抵抗失巢凋亡的能力在肿瘤侵袭转移过程中起着非常重要的作用。本实验中设计hnRNP A2/B1的siRNA并转染乳腺癌细胞MCF-7，发现转染后乳腺癌细胞株MCF-7凋亡明显增加，说明hnRNP A2/B1 蛋白表达受抑制后，可促进细胞凋亡，这表明hnRNP A2/B1有可能是通过抗凋亡影响乳腺癌发生。

综上所述，本实验中我们发现hnRNP A2/B1在乳腺癌组织中的表达显著增高，推测hnRNP A2/B1高表达可能与乳腺癌的发生有关；通过RNAi干预、降低hnRNP A2/B1的表达水平可以促进乳腺癌细胞凋亡，提示hnRNP A2/B1可能通过抗肿瘤细胞失巢凋亡实现肿瘤的发生和转移。本实验结果有助于丰富对乳腺癌发生、转移分子机制的认识，并为寻找干预乳腺癌侵袭转移的靶点提供了一定的理论支持，有助于改善乳腺癌患者的预后。

[1] Bland KI， Beenken SW， Copeland EM. The breast In： Brunicardi FC，Ande rson DK， Billiar TR， Dunn DL， Hunter JG， Pollock RE， editors Schwart'z Principiesof surgery 8thed[M]. New York： Mc Graw-H ： 2008： 453-496.

[2] 王仕杰，顾林，李树玲.等.乳腺癌[M].北京：科学技术出版社，2009：27.

[3] Zech VF，Dlaska M，Tzankov A，et a1．Prognostic and diagnostic relevance of hnRNP A2/B1，hnRNP B1 and S100 A2 in non-small cell lung cancer[J]． Cancer Detect Prey，2011，30(5)：395-402．

[4] Mili S，Shu HJ，Zhao Y，et al. Distinct RNP complexes of shuttling hnRNP proteins with pre-mRNA and mRNA：candidate intermediates in formation and export of mRNA[J]. Mol Cell Biol， 2010， 21 (21) : 7307-7319.

[5] 李润生,操乐杰.核内不均一核蛋白 A2/B1 在肺癌诊断上的进展[J].国外医学内科学分册,2005,32(9):401-404.

[6] Pino I , Pio R, Toledo G, et al . Altered pattern s of expression of members of the heterogeneous nu clear ribonucleo protein ( hnRNP ) family i n l ung cancer[J]. Lung Cancer , 2011, 41( 2 ): 131-143.

[7] Sueoka E, Goto Y, Sueoka N et al . Hetero geneous nuclear ribonucl eoprotein B 1 as a ne w marker of earl y detect i on for hum an lung cancer [J]. Research, 2009 , 59( 7 ) : 1404-1407.

[8] 林嫀.免疫组化检测在乳腺癌预后及术后化疗中的应用[J].临床肿瘤杂志,2007,12(7):534-536.

[9] 邵志敏.乳腺癌转移机制的研究及其临床应用[J].中华乳腺病杂志(电子版), 2009, 3(5)：475-479.

[10] Zech V, Dlaska M, Tzankov A, et al. Prognostic and diagnostic relevance of hnRNP A2/ B1, hnRNP B1 and S100 A2 in non-small cell lu ng cancer [ J] . Cancer Detect Prev, 2006, 30( 5) : 395-402.

[11] Zhou J , Mulshine JL, Unsworth FJ, et al . Purification and characterization of a protein that perm it s earl y detect ion of lung cancer [ J] . J Biol Chem, 2007, 271( 18) : 10760-10766.

[12] Gidenon D,Michael J,Matunis J, et al. Hn RNP proteins and the biogensi of mRNA[ J] .Annu Rev Biochem, 2003, 62: 289-321.

[13] Schenkel J, Sekeris CE,Alonso A, et al . RNA-binding properties of hnRNP proteins[ J] . Eur J Biochem, 2008, 171( 3) : 565-569.

[14] Erlitzki R, Fry M. Sequence-specific binding protein of s ingle-stranded and unimolecular quadruples telo meric DNA from rat hepatocytes[ J] . J Biol Chem, 2007, 272( 25) : 15881-15890.

[15] Kamma H, Fujimoto M, Fujiwara M, et al. Interaction of hnRNR A2/ B1 is oforms with telomeric ssDNA and the in vitro function[ J] . Biochem Biophys Res Commun, 2007, 280(3) : 625-630.

[16] Mckay SJ, Cooke H. hnRNP A2/ B1 binds specifically to single stranded vertebrate telomeric repeat TTAGGGn [ J] . Nucleic Acids Res, 2002, 20( 24) : 6461-6464.

[17] Mizukami K, Kamma H, Ishikawa M, et al . Immunohis tochemical study of the hnRNP A2 and B1 in the rat forebrain[ J] .Neuroreport , 2000, 11( 14) :3099-3102.

[18] Montuenga LM, Zhou J,Avis I, et al. Expression of heterogeneous nuclear ribo nucleoprotein A2/ B1 changes with critical stages of mammalian lung development [ J] .Am J Respir Cell Mol Biol, 2008, 19( 4) : 554-562.

[19] Kozu T, Henrich B, Schafer KP. Struc true and expression of the gene (HNRP A2/ B1) encoding the human hnRNP protein A2/ B1 [ J] . Genomics, 2005, 25( 2) : 365-371.

[20] Kamma H, Satoh H, Matusi M, et al. Characterization of hnRNP A2 and B1 using monoclonal at i bodies: intracellular distribution and metabolism through cell cycle[J] . Immunol Lett , 2001, 76( 1) : 49-54.

[21] Kamma H, Horiguchi H, Wan L, et al. Molecular characterization of the hnRNP A2/ B1 proteins: tissue-specific express ion and novel is oforms [J] .Exp Cell Res, 2006, 246( 2) : 399-411.

[ 22] Kamma H，Fujimoto M，Fujiwara M，et al. Interaction of hnRNP A2 /B1 isoforms with telomeric ssDNA and the function[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2011， 280 (3) : 625-630.

[23] Kamma H, Fujmoto M. Interaction of hnRNPA2 / B1 isoformer with telomeric ssRNA and the in vitro function [J]. Biophys Res Commun, 2008,280(3):625-630.

[24] Zhou J, Nong L, Wolch M, et al. Expression of early lung cancer detection marker: hnRNPA2 / B1, and its relation to microsatellite alteration in non-small cell lung cancer [J].Lung Cancer,2010 34(3):341-350.

[25] Pino I,Pio R, Toledo G, et al. Altered patterns of expression of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) family in lung cancer [J].Lung Cancer,2003,41(2):131-143.

Study on the expression of hnRNP A2/B1 and its effect on apoptosis in breast cancer

LiuShu,WangLan,WuPeixin.

GuiyangMaternalandChildren'sHealth-CareHospital.Guiyang550003,China.

Objective To detect the expression of hnRNP A2/B1 in breast cancer tissue and to investigate the effect of hnRNP A2/B1 on apoptosis of breast cancer cell line MCF-7. Methods 40 breast cancer tissue samples were from Guiyang Maternal and Children's Health-Care Hospital from January, 2005 to January, 2009. 20 breast fibroadenoma tissue samples were used as control. The expression of hnRNP A2/B1 in breast cancer was detected by Immunohistochemistry (IHC). hnRNP A2/B1 siRNA was transfected into breast cancer cell line MCF-7. Apoptosis of MCF-7 was investigated using TUNEL. Results 36 of 40 breast cancer tissue samples were positive for the expression of hnRNP A2/B1, while only 3 of 20 breast fibroadenoma tissue samples were positive. There were statistical significantly differences on hnRNP A2/B1 expression between breast cancer and breast fibroadenoma (P<0.01). After hnRNP A2/B1 siRNA was transfected into breast cancer cell line MCF-7, the apoptosis of MCF-7 cells was significantly increased. Conclusion hnRNP A2/B1 is highly expressed in breast cancer than that in breast fibroadenoma. Transfection with hnRNP A2/B1 siRNA can promote the apoptosis of breast cancer cells.

Breast cancer cell; hnRNP A2/B1; Apoptosis

R-33；R73-3

A

1000-744X(2016)02-0123-04

2015-11-12)